钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ质粒的构建和表达及其与Ca_V1.2通道结合的鉴定

摘要

目的 构建钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）长片段的融合蛋白质粒，表达、提取、纯化，并鉴定其与CaV1.2通道蛋白的结合。方法 将提取的pGEX-6p-1/CaMKⅡ长片段质粒转化到原核大肠杆菌BL21感受态细胞，摇床培养箱中培养12h，添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，促进GST融合蛋白的表达。采用DTT联合超声破碎法，谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B (GS-4B)分离、纯化GST-CaMKⅡ长片段后，经过PreScission蛋白酶处理，切除GST标签，得到CaMKⅡ长片段蛋白。采用15%SDS-PAGE鉴定CaMKⅡ长片段蛋白的分子量和相对纯度；采用Bradford方法测定纯化后蛋白的浓度；采用pull-down结合Western blotting鉴定其与CaV1.2通道蛋白的结合能力。结果 测序结果表明，CaMKⅡ长片段构建成功。通过DTT联合超声破碎法，得到了较高纯度和浓度的长片段CaMKⅡ蛋白，并能够与心肌CaV1.2钙通道末端CT1蛋白结合。结论 本研究成功构建了CaMKⅡ长片段钙调蛋白激酶融合蛋白质粒，提取、纯化了能够与CaV1.2通道蛋白结合并具有生物活性的CaMKⅡ长片段蛋白，为深入研究CaMKⅡ蛋白的功能奠定了基础。

关键词

钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ / 质粒构建 / 分离 / 纯化 / pull-down