长QT综合征相关钙调蛋白突变体E141G的C末端片段载体构建和蛋白制备

摘要

目的 构建长QT综合征（LQTS）相关钙调蛋白（CaM）突变体E141G的C末端片段（C-lobeE141G）原核表达载体并进行蛋白表达、纯化及活性鉴定。方法 将C-lobeE141G cDNA片段插入PGEX-6p-3质粒载体后转化大肠杆菌BL21感受态细胞，异丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）诱导谷胱甘肽-S-转移酶（GST）融合蛋白表达。利用Glutathione-Sepharose 4B beads对融合蛋白进行分离纯化，经蛋白酶切除GST标签后，分别采用SDS-PAGE及BCA方法检测纯化后的目的蛋白纯度及浓度，GST pull-down方法和膜片钳技术检测纯化后蛋白活性。结果 GST-C-lobeE141G融合蛋白高表达，纯化后获得高纯度、高浓度C-lobeE141G蛋白。纯化后C-lobeE141G蛋白具有能与CaV1.2型钙通道结合并维持大鼠心室肌细胞通道开放的活性。结论 成功构建可以表达生物活性蛋白的C-lobeE141G原核表达载体，可为CaM的C-lobe位点突变介导的LQTS机制研究提供材料基础。

关键词

钙调蛋白 / C末端片段 / 突变体 / 融合蛋白