METTL3介导Cry2 m⁶A甲基化修饰促进人肝细胞癌Huh-7细胞乐伐替尼耐药

摘要

目的 探讨隐花色素蛋白2（Cry2）及其N6-甲基腺苷（m⁶A）甲基化修饰在人肝细胞癌（HCC）细胞乐伐替尼耐药中的作用。方法 体外培养人HCC细胞系Huh-7及其乐伐替尼耐药细胞株（Huh-7/LR）。向Huh-7/LR细胞中转染si-Cry2、oe-Cry2、si-甲基转移酶样蛋白3（METTL3）、oe-METTL3以及干扰阴性对照（si-NC）和过表达空载（Vector）质粒，将未转染质粒的Huh-7/LR细胞作为对照。采用MTT法检测细胞对乐伐替尼的药物敏感性；流式细胞术检测各组细胞凋亡率；比色法检测细胞中RNA m⁶A甲基化水平；甲基化RNA免疫共沉淀法检测各组细胞中Cry2 RNA m⁶A甲基化水平；实时定量PCR和Western blotting检测各组细胞中Cry2和METTL3 mRNA和蛋白表达水平。结果 与Huh-7比较，Huh-7/LR细胞对乐伐替尼的敏感性显著降低（P<0.05），耐药指数为6.320；同时，Huh-7/LR细胞中Cry2 mRNA和蛋白表达水平较Huh-7细胞显著降低（P<0.01）,m⁶A甲基化水平和METTL3蛋白表达水平显著升高（均P<0.05）。过表达Cry2可显著增强Huh-7/LR细胞对乐伐替尼的敏感性，并促进细胞凋亡（P均<0.05）。沉默METTL3可显著降低Huh-7/LR细胞Cry2 m⁶A甲基化水平（P<0.01），上调Cry2 mRNA和蛋白表达水平，提高Huh-7/LR细胞对乐伐替尼的敏感性，促进细胞凋亡（P均<0.05）,METTL3过表达则呈现相反的作用结果。然而，沉默Cry2可显著逆转METTL3基因沉默对Huh-7/LR细胞乐伐替尼的增敏作用（P<0.05）。结论 METTL3介导Cry2 m⁶A甲基化水平升高导致Cry2表达下调，进而促进人HCC细胞乐伐替尼耐药。

关键词

肝细胞癌 / 乐伐替尼 / 隐花色素蛋白2 / N6-甲基腺苷甲基化 / 耐药