拟南芥ADF7 Ser6磷酸化对花粉萌发和花粉管伸长的调控

Regulation of ADF7 Ser6 phosphorylation on pollen germination and pollen tube elongation in Arabidopsis

摘要

为了探究花粉管微丝细胞骨架对花粉管极性生长的影响，本研究构建了ADF7^S6A（非磷酸化形式的ADF7）和ADF7^S6D（磷酸化形式的ADF7）的pEarlyGate100-mCherry载体，与标记微丝荧光的蛋白GFP-fABD2-GFP共表达于烟草中，发现ADF7 Ser6位点的磷酸化状态影响ADF7与微丝的结合，ADF7^S6A与微丝共定位，ADF7^S6D与微丝共定位消失。通过花粉体外培养实验和苯胺蓝染色，观察拟南芥花粉萌发和花粉管伸长，发现不同磷酸化状态下ADF7对微丝解聚剂LatB的敏感性不同：ADF7^S6A过表达株系对LatB处理不敏感，但会导致花粉萌发率下降，花粉管长度变短；ADF7^S6D过表达株系对LatB较敏感，在一定程度上挽救了花粉萌发率下降和花粉管变短的异常表型。这些结果表明，ADF7 Ser6位点的磷酸化是维持拟南芥花粉管微丝细胞骨架动态稳定，确保花粉正常萌发和花粉管正常伸长所必须的。

Abstract

To investigate the impact of the pollen tube actin cytoskeleton on its polarized growth， we generated pEarlyGate100-mCherry constructs for ADF7^S6A （non-phosphorylatable） and ADF7^S6D （phosphomimetic） and co-expressed them with the actin marker GFP-fABD2-GFP in tobacco. ADF7^S6A co-localized with actin filaments， whereas ADF7^S6D lost co-localization with actin filaments， indicating that the phosphorylation status of Ser6 regulates ADF7 binding to F-actin. In vitro pollen culture assays and aniline blue staining revealed that ADF7^S6A-overexpressing lines were insensitive to the actin depolymerizer LatB but showed reduced pollen germination rates and shorter pollen tubes， whereas ADF7^S6D-overexpressing lines were more sensitive to LatB and partially rescued these defects. These findings demonstrate that phosphorylation of ADF7 at Ser6 is essential for maintaining the dynamic stability of the actin cytoskeleton and ensuring normal pollen germination and pollen tube enlogation in Arabidopsis.

Graphical abstract

关键词

肌动蛋白解聚因子7 / 磷酸化 / 花粉萌发 / 花粉管伸长

Key words

ADF7 / phosphorylation / pollen germination / extension of pollen tube

双受精是被子植物生殖发育的独特特征，花粉粒从花药转移到柱头表面，随后在柱头上萌发形成具有极性的花粉管，花粉管持续生长并进入胚囊，随后释放出精子，雌雄配子相互接触，最终完成双受精过程^［1］。花粉管的极性生长是完成双受精过程必不可少的一环，花粉管生长缺陷将影响作物产量。水稻、玉米、小麦等主要粮食作物均为被子植物，其产量和品质影响着世界粮食安全^［2］。因此，研究花粉管的生长，提高农业产量，对于农业发展有着重要的理论意义。

花粉管的生长受到许多因素的影响，如生长素、pH值、Ca²⁺浓度、细胞骨架以及细胞质流。细胞骨架主要包括微丝细胞骨架（MF）和微管细胞骨架（MT）。微丝细胞骨架在花粉管尖端生长过程中为细胞器的运动和细胞质流动提供轨迹，影响花粉管生长的速度和方向，而微管骨架仅影响花粉管生长方向^［3］。花粉管微丝细胞骨架受到多种肌动蛋白结合蛋白的调节，如肌动蛋白捆绑蛋白FIM5在花粉管顶端捆绑微丝，其突变体花粉管顶端肌动蛋白丝弯曲^［4］；拟南芥绒毛蛋白VLN2、VLN5在柄部捆绑稳定微丝，在顶端切断微丝促进微丝周转^［5-6］。

肌动蛋白解聚因子ADF作为一种肌动蛋白结合蛋白，在真核生物中高度保守，ADF促进肌动蛋白解聚，诱导肌动蛋白成核和肌动蛋白组装^［7］。ADF的作用取决于ADF的浓度：低浓度有利于切割微丝，高浓度有利于促进肌动蛋白单体成核^［8］。拟南芥ADF基因家族被分为4个亚类，共有11位成员。Ⅰ亚类包括ADF1到ADF4，它们在除花粉之外的所有器官和组织中表达，其中ADF3的表达最强烈；Ⅱ亚类的ADF7和ADF10在花粉中特异性表达，ADF8和ADF9在根毛母细胞中特异性表达；Ⅲ亚类（ADF5和ADF9）以及仅包含ADF6的Ⅳ亚类在多个器官和组织中广泛表达，但其表达水平低于Ⅰ亚类成员^［9］。其中Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ亚类都具有微丝解聚活性，Ⅰ亚类解聚活性最强，而Ⅲ亚类不同于其他成员，表现出微丝成束活性^［10］。据报道，在adf7和adf10突变体中，花粉管微丝成束频率增加，花粉管的生长受到抑制，并且花粉萌发和花粉管伸长对微丝解聚剂LatB表现出抗性^［11-12］，这些研究表明，ADF7和ADF10调节花粉管中肌动蛋白的周转。

植物体内ADF活性受到pH值、肌动蛋白互作蛋白、特异性磷脂酰肌醇和自身磷酸化状态等的调控。ADF家族N端存在保守的磷酸化位点，ADF N端Ser的磷酸化对其结合F-肌动蛋白能力十分重要，ADF的N端被磷酸化后，结合F-肌动蛋白能力降低^［13］。例如，拟南芥ADF4和ADF1在Ser6位点被磷酸化后，结合、解聚F-肌动蛋白能力降低^［14-15］。在烟草中，过表达ADF1抑制花粉管的生长，而Ser6的磷酸化降低了其对花粉管的抑制作用^［16］，CDPK16磷酸化ADF7 Ser128位点促进花粉管肌动蛋白的周转^［17］，AGC1.7磷酸化ADF7的Ser6、Ser103、Ser104调控花粉管的生长发育^［18］。综上所述，ADF的磷酸化状态可通过影响其微丝解聚活性而影响花粉管的生长发育。

本研究观察ADF7的Ser6磷酸化状态下拟南芥花粉萌发和花粉管伸长情况，有助于理解拟南芥花粉管生长发育的机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

哥伦比亚野生型植株（WT）和ADF7过表达株系（#1和#2）由实验室提供。本研究构建并筛选出了过表达ADF7^S6A（#1和#3）和ADF7^S6D（#7和#9）株系用于花粉体外培养；将ADF7、ADF7^S6A、ADF7^S6D基因转入pEarlyGate100-mCherry载体中，用于观察ADF7和微丝的共定位。

1.2 实验方法

1.2.1 过表达株系构建

将构建的pCAMBIA1307-ADF7^S6A-4MYC和pCAMBIA1307-ADF7^S6D-4MYC转化农杆菌，振荡培养后收菌，用浸染液稀释至OD₆₀₀约为1.0，定容至100 mL，4 ℃避光静置30 min。浸染前加入20 μL Sliwet L-77，摇匀，剪去WT植株的全部果荚，浸染开放的花朵50 s，避光过夜培养。收取浸染植株种子于含20 mg/L的潮霉素的MS培养基筛选，通过根长筛选出阳性苗，继续筛选直到得到纯合株系。

1.2.2 植物总蛋白提取

剪取3片植株叶片于研磨仪低温研磨1~3 min，按照3∶1质量体积加入总蛋白提取液，将混合均匀的溶液放在冰上静置30 min，随后转移至低温离心机中，以12 000 r/min的转速离心15 min，待离心完成后取出上清液，加入蛋白质上样缓冲液，最后95 ℃变性10 min。

1.2.3 Western-blot分析

将变性的蛋白通过SDS-PAGE电泳分离蛋白，电泳结束后选取提前在甲醇溶液里激活的适当大小PVFD膜，采用三明治方式固定凝胶、PVFD膜和海绵，100 V冰浴90 min完成转膜；把PVDF 膜放入含5%脱脂牛奶的溶液中，在室温条件下封闭3 h；封闭结束后，将膜置于4 ℃冰箱内孵育一抗，之后用TBST缓冲液洗涤膜3次，每次洗涤时长为10 min；接着在室温下孵育二抗60 min，再次洗涤膜3次，最后加入化学发光试剂，用Bio-rad成像系统观察目的蛋白条带。

1.2.4 微丝共定位实验

将表达ADF7、ADF7^S6A、ADF7^S6D基因的pEarlyGate100-mCherry载体转化农杆菌与pCAMBIA1309-GFP-fABD2-GFP和p19质粒分别培养后用烟草浸染液稀释至OD₆₀₀值约为1，三者等量混合，注射烟草后避光过夜培养，在烟草中表达3 d后，剪取叶片使用共聚焦显微镜观察荧光共定位情况。

1.2.5 花粉萌发率与花粉管长度统计

选取6~8 wk大小的拟南芥，于上午9：30—12：00采摘花朵，放置于1.5 mL EP管中，加入花粉体外培养液，振荡并低速离心，获得黄绿色沉淀（即为花粉），去除上清及杂质后重悬沉淀，涂布于花粉固体培养基，28 ℃培养3 h后在显微镜下进行观察，用Image J进行统计。探究LatB对花粉萌发率与花粉管伸长的影响时，在相应浓度的LatB液体基及固体培养基上培养花粉即可。

1.2.6 苯胺蓝染色法

取拟南芥授粉24 h后的雄蕊于FAA固定液（乙醇∶氯仿∶冰醋酸按6∶3∶1混合）中过夜固定，随后用ddH₂O清洗干净，吸干多余水分，用8 mol/L NaOH处理12 h，ddH₂O清洗，吸干多余水分，再用苯胺蓝染色液过夜处理，用BX 51 microscope荧光显微镜观察花粉荧光。

2 结果与分析

2.1 ADF7结合和解聚微丝活性受到Ser6位点磷酸化的调控

通过观察微丝荧光GFP（绿色）和ADF7、ADF7^S6A（模拟非磷酸化状态）和ADF7^S6D（模拟磷酸化状态）蛋白mCherry荧光（紫色）发现：白色箭头所指部分ADF7和ADF7^S6A蛋白紫色荧光与微丝绿色荧光重叠，而ADF7^S6D蛋白紫色荧光与微丝绿色荧光不重叠（图1a）。随后，测量白色短线部分的荧光强度发现：ADF7和ADF7^S6A所代表的紫色曲线与微丝绿色曲线表现出大致相同的变化趋势，而ADF7^S6D所代表的紫色曲线变化趋势却与微丝绿色曲线不一致（图1b）。以上结果表明，ADF7与微丝的结合活性受其Ser6位点磷酸化的调控，磷酸化形式的ADF7不能结合微丝。这与文献［18］报道的ADF7 Ser6位点磷酸化状态影响微丝解聚活性一致。

2.2 ADF7^S6A和ADF7^S6D过表达株系中ADF7蛋白水平鉴定

我们构建了ADF7^S6A和ADF7^S6D过表达株系，经潮霉素筛选和Western Blot蛋白水平验证，获得两个阳性株系（图2）。

2.3 花粉萌发和花粉管伸长受到ADF7 Ser6位点磷酸化的调控

我们在体外培养ADF7、ADF7^S6A、ADF7^S6D过表达株系的花粉，对花粉萌发率和花粉管长度进行统计。结果显示：ADF7过表达株系、ADF7^S6D过表达株系与野生型（WT）花粉萌发率无显著差异，而ADF7^S6A过表达株系花粉萌发率显著低于其他株系（图3a、b）；在花粉管伸长上也表现出相同的结果，ADF7^S6A过表达株系花粉管长度显著低于其他株系（图3a、c）。

为了进一步分析ADF7 Ser6位点磷酸化状态对花粉管伸长的影响，我们进行花粉管染色。结果显示（图4），在花粉管伸长3 h后，ADF7^S6A、ADF7及ADF7^S6D三种过表达株系花粉管长度无显著差异；在花粉管伸长5 h后，ADF7^S6A过表达株系花粉管长度显著短于ADF7和ADF7^S6D过表达株系；在花粉管伸长8 h后，ADF7^S6A过表达株系花粉管长度显著低于ADF7过表达株系，ADF7^S6D过表达株系花粉管长度低于ADF7过表达株系，但高于ADF7^S6A过表达株系。上述结果说明，当ADF7蛋白Ser6位点无法发生磷酸化时，会表现出花粉管萌发率下降、花粉管长度降低等异常情况。

随后，我们将花粉置于不同浓度LatB培养基上培养，观察不同磷酸化状态下ADF7对微丝骨架的影响。对花粉萌发率进行分析（图5a）：ADF7^S6A过表达株系对LatB处理不敏感，ADF7^S6D过表达株系对LatB处理十分敏感，ADF7过表达株系对LatB处理的敏感性介于ADF7^S6A和ADF7^S6D之间；ADF7过表达株系的花粉萌发率显著高于ADF7^S6D过表达株系，但低于ADF7^S6A过表达株系。对花粉管长度进行分析（图5b）：ADF7^S6A和ADF7过表达株系在4 nmol/L LatB处理后花粉管长度无明显变化，对LatB处理不敏感；而ADF7^S6D过表达株系和WT株系在4 nmol/L LatB处理后花粉管长度变短，对LatB处理较敏感。

这些结果表明，ADF7 Ser6位点的磷酸化是维持拟南芥花粉管微丝细胞骨架动态稳定，确保花粉正常萌发和花粉管正常伸长所必须的。

3 讨论

花粉中含有大量微丝，研究花粉管微丝细胞骨架对于花粉管的极性生长至关重要。肌动蛋白丝动力学受到多种肌动蛋白结合蛋白的协同调控，其中ADF家族具有强烈的微丝解聚活性，其活性对于维持肌动蛋白动态平衡十分重要。ADF7和ADF10在花粉管中特异性表达，但他们在细胞内的定位和功能不同，ADF10在花粉萌发和花粉管生长过程中不能取代ADF7的活性^［19-20］。我们发现，ADF7 Ser6位点磷酸化影响其微丝结合活性。当ADF7 Ser6位点被磷酸化时，微丝结合活性降低（图1），这与CKL2磷酸化ADF4的Ser6位点降低其微丝解聚能力相似^［21］。

我们构建了ADF7^S6A和ADF7^S6D过表达株系，模拟非磷酸化形式和磷酸化形式的ADF7。ADF7^S6A过表达株系微丝切割活性不受磷酸化抑制，导致微丝骨架过度切割，进而破坏花粉管微丝骨架的正常结构，最终损害花粉管的极性生长，表现为花粉萌发率下降及花粉管长度变短。ADF7^S6D过表达株系ADF7切割活性受到磷酸化抑制，虽然可以挽救ADF7^S6A过表达株系造成的花粉萌发率降低和花粉管长度变短，但会导致微丝成束增加，不能维持花粉管微丝细胞骨架的动态稳定。这表明，ADF7调控拟南芥花粉微丝细胞骨架的动态稳定受到其Ser6位点磷酸化的影响，这个过程对于拟南芥花粉管生长发育十分重要。

ADF7活性同时受到磷酸化和去磷酸化的调控^［22］。AGC1.7磷酸化调控ADF7是花粉萌发和花粉管生长所必需的。ADF7过表达株系表现出花粉萌发和花粉管长度异常^［18］，可能存在蛋白去磷酸化ADF7，从而维持花粉管中ADF7表达量的动态平衡。值得注意的是，CPK3磷酸化ADF4的Ser105和Ser106调控其微丝结合和解聚活性，这些位点在ADF家族中是保守的^［23］；AGC1.7磷酸化ADF7的Ser6、Ser103、Ser104调节花粉管的生长，ADF7 Ser6/103/104D可以挽救agcdm（AGC1.5和AGC1.7双突变体）降低的花粉萌发率和花粉管长度^［18］。

综上所述，ADF7 Ser6位点磷酸化是拟南芥花粉管正常生长所必需的。本研究进一步探索了ADF7在拟南芥花粉管极性生长过程中的生物学功能，也为拟南芥花粉管生长发育机制的研究做了一定补充。

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基金资助

高校基本科研业务费(2021SCU12098)