白念珠菌唑类耐药分子检测体系的建立

摘要

随着免疫抑制剂与侵入性手术的应用，侵袭性真菌病的发病率逐渐上升，而由此出现的抗真菌药物大量使用也导致了真菌耐药性的增强．其中，白念珠菌(Candidaalbicans)对唑类药物耐药性日益明显，这对开发早期临床耐药性诊断方法提出了更大的需求．相关研究显示，白念珠菌的耐药性涉及到多种机制，其中erg11基因上的热点区突变是其产生唑类耐药性的主要机制之一．本研究旨在基于多色探针熔解曲线分析技术(MMCA)建立一种针对白念珠菌唑类耐药的分子检测方法，从而对3个热点突变区内的4种主要的突变类型进行基因分型．研究纳入了11株耐药和22株敏感的白念珠菌，通过对其进行药敏检测、耐药相关基因突变类型鉴定，建立真菌耐药表型与耐药基因型之间的联系．药敏结果显示，11株耐药株和22株敏感株的最低抑菌浓度(MIC)值分别为16～64μg/m L和0.5～1.0μg/m L．耐药基因型鉴定结果显示有erg11HS1热点区突变的菌株9株，erg11HS3热点区突变的菌株2株，未能鉴定到erg11HS2热点区突变的菌株，相关突变型与耐药性之间的联系符合预期结果．在此基础上，通过设计数对特异性引物和荧光探针，并筛选最佳反应程序，建立了一种鉴定有关突变型与野生型的MMCA检测体系．对该检测体系的效果进行了评估和验证：所有4种突变型和野生型均被准确分型，两者的溶解温度差异均大于3.5℃，检出限最低可达1.9×102拷贝数/m L，扩增效率均大于90%．在33例白念珠菌的样本中，以一代测序为标准，该体系检测的一致率为93.94%(31/33)，不同物种间无特异性交叉．本研究为白念珠菌病的早期唑类药物耐药性诊断提供了新方法．

关键词

白念珠菌 / 耐药性 / 探针熔解曲线分析 / 突变型