TcPINK1蛋白的表达、纯化及活性检测

摘要

PINK1是一种定位在线粒体外膜上的丝氨酸/苏氨酸激酶，可感受线粒体损伤，通过招募PARKIN启动线粒体自噬，其功能性突变与家族性帕金森氏症（PD）密切相关．为探索PINK1家族蛋白N端对激酶催化功能的影响，本研究将赤拟谷盗PINK1（TcPINK1）3种不同长度N端截短体的基因克隆至pET15b表达载体，然后转化至大肠埃希氏菌BL21（DE3）中，并对诱导剂IPTG的浓度、诱导温度等进行优化．目标蛋白经Ni-NTA亲和层析、阴离子交换层析和分子筛纯化后，利用FITC标记的泛素作为底物进行激酶活性检测．实验显示，在OD₆₀₀值为0.6～0.8、表达温度为16℃、IPTG浓度为0.4 mmol/L、诱导表达18 h时，TcPINK1不同截短体蛋白可溶性表达量均较高，并显示出磷酸化泛素的活性．分子排阻色谱和酶活性检测结果显示，TcPINK1的N端αA螺旋对激酶的聚集状态及活性具有调节作用．TcPINK1和人源PINK1（hPINK1）的序列和结构对比均显示激酶区具有较高同源性，对TcPINK1酶活性调节机制的研究与探究可为PINK1蛋白家族的生物学功能提供重要信息．

关键词

帕金森氏症 / TcPINK1 / AlphaFold 3 / 原核表达