猫杯状病毒反向遗传系统的建立及弱毒株的构建

摘要

为了构建猫杯状病毒(FCV)弱毒疫苗候选株，从杭州流行的FCV毒株FCV-HZ-DF-19中提取基因组RNA,利用RT-PCR技术分3段扩增获得FCV全基因组，通过同源重组的方法将全长基因组克隆至已插入榔头状核酶(HamRz)和丁型肝炎核酶(HdvRz)的PCI载体，获得中间质粒pPCI-FCV;以pPCI-FCV为模板扩增获得含HamRz、HdvRz和FCV全基因组的产物FCV-H,并将其连接到BAC载体中获得含有FCV全基因组的克隆pBAC-FCV。将pBAC-FCV转染猫肾细胞F81连续传代后收获病毒。针对FCV毒力相关的LC基因进行缺失，获得感染性克隆pBAC-FCV-ΔLC,通过转染表达FCV-VP1蛋白的猫肾细胞系进行病毒拯救。结果显示，拯救毒株rBAC-FCV和LC基因缺失毒株rBAC-FCV-ΔLC均可产生细胞病变；测序结果表明，拯救毒株的基因序列与亲本毒株FCV-HZ-DF-19一致，且生长曲线与亲本毒相似，而基因缺失毒株的生长则慢于亲本毒株，产生的噬斑大小也明显小于亲本毒株，表明缺失LC基因后病毒毒力下降。结论：本研究成功构建了FCV的反向遗传系统及基因缺失弱毒株，为后续弱毒疫苗研发和FCV生物学特性研究奠定了基础。

关键词

猫杯状病毒 / 反向遗传学技术 / 同源重组 / 基因缺失