奶牛生物钟基因CLOCK的真核表达载体构建、生物信息学分析及其组织表达谱

摘要

旨在克隆奶牛昼夜运动输出周期(circadian locomotor output cycles kaput, CLOCK)基因的蛋白编码区序列(coding sequence, CDS),构建该基因的真核表达载体，检测CLOCK基因在奶牛不同组织的相对表达丰度，并预测分析奶牛CLOCK蛋白的高级结构、理化性质及其功能特征。以奶牛肝脏组织cDNA为模板，通过PCR扩增奶牛CLOCK基因CDS区片段，利用同源重组法将其连接至pcDNA3.1-Puro-N-3HA载体；经酶切与测序鉴定后，将鉴定正确的质粒命名为pcDNA3.1-Puro-N-3HA-bCLOCK;将pcDNA3.1-Puro-N-3HA空质粒和pcDNA3.1-Puro-N-3HA-bCLOCK重组质粒分别转染至HEK293T细胞，通过蛋白质免疫印迹(Western blot)检测CLOCK蛋白的过表达效率；提取奶牛的心、肝、脾、肺等10个组织的总RNA并反转录为cDNA,以此为模板通过实时定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)检测CLOCK基因在奶牛不同组织的表达变化；同时，利用生物信息学软件对奶牛CLOCK基因及其编码蛋白进行功能预测分析。琼脂糖凝胶电泳结果显示，成功克隆了奶牛CLOCK基因全长CDS区片段。酶切与测序结果显示，pcDNA3.1-Puro-N-3HA-bCLOCK真核表达载体构建成功。Western blot结果表明，该真核表达载体在HEK293T细胞中成功表达HA-CLOCK融合蛋白。qPCR结果表明，CLOCK基因在心、肝、脾、肺等10个组织中均有表达，其中在心脏表达最高，在小肠表达最低。生物信息学分析结果表明，奶牛CLOCK基因的CDS区与绵羊、山羊、骆驼的相似性较高；奶牛CLOCK蛋白由845个氨基酸组成，分子质量为95.12 kDa,无跨膜结构域与信号肽，为亲水性蛋白，二级结构中富含α-螺旋；奶牛CLOCK蛋白的三级结构与绵羊、人和小鼠的差异极小。结论：本研究成功克隆了奶牛CLOCK基因全长CDS区片段并构建了其真核表达载体，qPCR检测CLOCK基因在奶牛不同组织的表达谱，通过生物信息学预测分析CLOCK蛋白的结构与功能特性，为进一步探究奶牛CLOCK基因的生物学功能提供理论依据。

关键词

奶牛 / 真核表达载体 / 生物钟 / 生物信息学分析 / 表达谱

基金资助

陕西省农业农村厅省级农业专项基金项目[NYKJ-2021-YL(XN)10]; 国家自然科学基金面上项目(31771301);国家自然科学基金青年科学基金项目(31602125); 中国博士后科学基金第11批特别资助项目(2018T111112)