非洲猪瘟病毒多重PMA-qPCR检测方法的建立及应用

摘要

本研究利用叠氮溴化丙锭(PMA)与多重荧光定量PCR(qPCR)技术相结合，建立了一种可以实现非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染性与非感染性(活/死病毒)鉴别的检测方法。通过对ASFV p72、CD2v、MGF110-14L基因保守序列设计特异性引物及探针，建立p72、CD2v、MGF110-14L基因的多重qPCR检测方法。结果显示，本研究建立的多重qPCR检测方法具有较强特异性，与其他常见猪病毒性原无交叉反应；同时，该方法具有较高灵敏度，p72、CD2v、MGF110-14L基因的重组质粒标准品最低检出限均为10~2copies/μL。为弥补qPCR技术不能有效区分样品中活/死病毒的缺陷，本研究将构建的多重qPCR与PMA技术相结合。当加入PMA终浓度为10μg/mL、暗孵育10 min、光照强度40 W、光照15 min时，PMA能够抑制灭活病毒基因的扩增且对活病毒基因的扩增无影响；对比普通qPCR与多重PMA-qPCR的灵敏度可知，两者的灵敏度均为10~2 copies/μL;将多重PMA-qPCR方法用于23份实际样品检测，结果显示，检测活病毒的准确率为100%,说明该方法能有效区分临床样品中具有感染性的ASFV。

关键词

非洲猪瘟病毒 / 多重PMA-qPCR / 基因缺失株 / 感染性病毒