犬细小病毒感染F81细胞microRNA荧光定量PCR内参基因的筛选

周宏专; 苏霞; 林路路; 齐颀; 张进; 徐福洲; 杨兵

畜牧与兽医 ›› 2023, Vol. 55 ›› Issue (03) : 96 -103.

周宏专, 苏霞, 林路路, 齐颀, 张进, 徐福洲, 杨兵

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摘要

犬细小病毒(canine parvovirus, CPV)是犬急性胃肠炎的主要病原之一，对犬类的健康造成极大危害。MicroRNA(miRNA)是小的、非编码的RNA,在转录后水平调节基因表达。荧光定量PCR(RT-qPCR)是评估miRNA表达水平最常用的方法，而合适的参考基因在RT-qPCR数据归一化中起着至关重要的作用。本研究在分析F81细胞空白对照组和感染CPV组小RNA高通量测序结果基础上，结合参考文献，在CPV感染后12 h和24 h,通过poly(A)延伸RT-qPCR定量方法检测候选内参基因小RNA的表达情况，并使用GeNorm、NormFinder和BestKeeper算法评估这些候选小RNA的稳定性。结果选取了5种高通量测序中表达相对稳定的miRNAs(dno-miR-186-5p、pha-miR-152、dno-miR-374a-5p、tch-miR-26a-2-5p和oga-miR-26b)和常用作参考基因的小核RNA U6(RNU6-1)、核仁小RNA(small nucleolar RNA)SNORD95以及SNORD96a,经过扩增分析及对高通量测序中差异表达的dno-miR-7-5p的定量验证发现，这些候选小RNA均具有较好的稳定性。其中pha-miR-152在检测样品中稳定性最好，可在CPV感染F81细胞中作为RT-qPCR法定量miRNA表达及数据均一化的合适参考基因。筛选出的pha-miR-152有助于研究miRNAs在CPV感染过程中的定量表达分析，为进一步研究F81细胞中miRNA调控CPV感染复制的分子机制研究提供可靠手段，也为其他相关物种miRNA定量研究中内参基因的选择提供参考。