猪FoxP3、IL-10双重实时荧光定量PCR方法建立及应用

摘要

旨在建立双重实时荧光定量PCR（RT-qPCR）方法，对叉头框蛋白P3（FoxP3）、白细胞介素10（IL-10）的RNA转录进行定量检测。设计并合成FoxP3、IL-10的扩增引物和荧光探针，优化引物浓度、退火温度，建立RT-qPCR方法，检测猪圆环病毒2型（PCV2）感染外周血调节性T淋巴细胞（Treg）和免疫器官中FoxP3和IL-10的mRNA含量；根据Western blot检测蛋白表达验证方法的可靠性。结果：建立的RT-qPCR方法呈现“S”型扩增曲线，相关系数R²≥0.99;转化生长因子-β（TGF-β）、干扰素-γ（IFN-γ）、白细胞介素2（IL-2）、白细胞介素4（IL-4）、白细胞介素6（IL-6）和白细胞介素17（IL-17）等基因的核酸模板和阴性对照均无扩增曲线，最低检测浓度10 copies/μL,批内、批间变异系数分别为0.87%、1.84%;PCV2攻毒组外周血Treg细胞中FoxP3和IL-10的mRNA含量均出现明显升高，FoxP3的mRNA含量在攻毒第14天到达峰值，IL-10的mRNA含量在攻毒第10天到达峰值，PCV2感染后导致胸腺、淋巴结和脾脏中FoxP3和IL-10转录水平升高；Western blot检测表明，FoxP3蛋白表达量在攻毒第14天、第28天，IL-10在攻毒第10天和第14天显著高于对照组，与RT-qPCR结果一致。综上，本研究建立的猪FoxP3、IL-10双重RT-qPCR方法具有特异、敏感、检测稳定可靠的特点，对于评价猪体的免疫应答水平和机体免疫稳态具有重要意义。

关键词

FoxP3 / IL-10 / 实时荧光定量PCR / Treg活化 / 免疫负调控