宿主细胞敲除G3BP2基因对塞内卡病毒复制的影响

摘要

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Ras GTP酶激活蛋白SH3结构域结合蛋白2（G3BP2）基因敲除的293T细胞系，并初步探讨了G3BP2基因缺失对于塞内卡病毒A（Senecavirus A,SVA）增殖的影响。采用激光共聚焦试验观察病毒感染是否引起应激颗粒的产生；设计、构建靶向G3BP2基因的px459-sgRNA表达载体并转染进293T细胞；通过嘌呤霉素压力筛选以及亚克隆得到细胞株，经过Western blot、基因测序的方式鉴定细胞株；CCK-8法测定细胞增殖速度；Western blot、RT-qPCR、噬斑试验分别检测SVA感染后病毒蛋白VP1的表达水平、VP1的拷贝数和细胞上清液的病毒滴度；设计并构建SVA核糖体进入位点（IRES）的双荧光素酶报告系统，双荧光素酶报告试验测定病毒启动子的启动活性。结果：病毒感染引起应激颗粒的产生；筛选得到1株G3BP2基因缺失10 bp的293T细胞系(HEK 293T G3BP2^-/-),其细胞活力与未敲除细胞相比无显著差异；Western blot、RT-qPCR、噬斑试验均显示G3BP2敲除后显著抑制了病毒的增殖；双荧光素酶报告试验表明G3BP2敲除后下调了病毒的翻译启动活性。综上，本研究获得了1株HEK 293T G3BP2^-/-细胞系，该细胞通过下调病毒的启动活性抑制病毒的增殖，为进一步探讨G3BP2对SVA复制的影响奠定基础。

关键词

G3BP2基因 / 基因敲除 / 塞内卡病毒A / 复制