PRRSV非结构蛋白NSP4及其3个主要结构域过表达慢病毒载体的构建及鉴定

摘要

旨在构建猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)NSP4蛋白及其3个主要结构域的过表达慢病毒载体，包装慢病毒并检测4种慢病毒在人单核细胞白血病细胞THP-1和猪肺泡巨噬细胞PAM中的表达。试验以质粒pXJ41-HA-NSP4为模板，分别扩增NSP4全长及其3个结构域NSP4-DⅠ、NSP4-DⅡ、NSP4-DⅢ片段，连接到pCD513B慢病毒表达载体中，构建重组质粒pCD513B-NSP4、pCD513B-NSP4-DⅠ、pCD513B-NSP4-DⅡ、pCD513B-NSP4-DⅢ;将慢病毒重组质粒与包装质粒pLP1、pLP2、pLP/VSVG共转染HEK-293T细胞，包装获得4种重组慢病毒rLV-NSP4、rLV-NSP4-DⅠ、rLV-NSP4-DⅡ、rLV-NSP4-DⅢ,并感染HEK-293T细胞测定病毒滴度；分别将4种重组慢病毒感染THP-1细胞、PAM细胞，荧光显微镜观察目的蛋白表达，荧光定量PCR(qPCR)检测目的基因转录水平，Western blot检测不同感染时间目的蛋白表达水平。结果：4种慢病毒rLV-NSP4、rLV-NSP4-DⅠ、rLV-NSP4-DⅡ、rLV-NSP4-DⅢ感染HEK-293T细胞的病毒滴度分别为2.2×10～6、2.8×10～6、2.5×10～6和2.5×10～6 TU/mL;荧光显微镜观察显示4种慢病毒感染THP-1细胞和PAM细胞后阳性细胞数均随时间的增加而增多；qPCR结果表明目的基因转录水平在慢病毒感染后60 h内随着感染时间增加而升高；Western blot表明4种慢病毒能够成功感染THP-1细胞和PAM细胞并稳定表达相应的目的蛋白，且蛋白表达水平随着感染时间增加而升高。综上，本研究成功包装PRRSV NSP4及其3个主要结构域重组过表达慢病毒，为进一步研究PRRSV NSP4及其3个结构域的功能奠定了基础。

关键词

猪繁殖与呼吸综合征病毒 / NSP4 / 慢病毒载体 / 鉴定