牦牛“海绵吸附”bta-miR-125b的lncRNA筛选验证及慢病毒载体构建

摘要

旨在筛选在牦牛卵泡发育过程中可能吸附bta-miR-125b的长链非编码RNA(lncRNA),并构建双荧光素酶载体与慢病毒过表达载体，为研究调控牦牛生殖相关lncRNA的功能及机制提供基础。利用miRanda与RNAhybrid数据库预测可能靶向牦牛bta-miR-125b的lncRNAs,筛选出bta-miR-125b具有“海绵吸附”作用的lncRNAs,由RNAhybrid进行结合位点预测，筛选出最优的lncRNA;采集牦牛卵巢分离卵泡并提取总RNA构建cDNA池，以RT-PCR技术扩增筛选所得lncRNA;在此基础上利用pmir-GLO载体构建技术构建该lncRNA野生型及突变型双荧光素酶报告载体，并将其与bta-miR-125b mimics共转染至293T细胞，检测双荧光素酶活性；最后利用慢病毒载体构建技术将测序正确的lncRNA与pHBLV-CMV-MCS-EF1-ZsGreen-T2A-puro载体同源区的片段同源重组，通过慢病毒包装系统(psPAX2:pMD2G)包装后感染293T细胞，计算感染效率及滴度。结果：两个数据库中的lncRNA-ARS-UCD1.2与bta-miR-125b存在紧密结合位点，扩增出lncRNA-ARS-UCD1.2的序列全长为1 552 bp;双荧光素酶活性检测表明牦牛lncRNA-ARS-UCD1.2与bta-miR-125b mimic具有靶向关系(P<0.01);同源重组后经酶切鉴定及测序验证表明成功构建了重组质粒，感染效率达(61.520±0.875)%,感染滴度为4×10～8 TU/mL,表明lncRNA-ARS-UCD1.2过表达慢病毒载体成功构建。综上，本试验筛选出牦牛“海绵吸附”bta-miR-125b的lncRNA,并验证了两者的靶向结合关系，同时成功构建了该lncRNA的过表达慢病毒载体，为下一步深入研究lncRNA在细胞中的功能机制奠定了基础。

关键词

牦牛 / 长链非编码RNA / bta-miR-125b / 海绵吸附 / 慢病毒载体