圆锥节丛孢菌AC-XJ株几丁质酶AC-chi6195基因的克隆表达及生物学活性研究

摘要

旨在探究圆锥节丛孢菌几丁质酶的生物学功能。在圆锥节丛孢菌新疆株AC-XJ全基因组测序基础上，选取几丁质酶基因AC-chi6195为研究对象，对其进行克隆与分子特征分析并原核表达获得重组蛋白，采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）比色法测定该重组蛋白的酶活性，分析该重组蛋白在不同pH值、温度、底物、金属离子及化学试剂条件下的酶学特性，将其作用于秀丽隐杆线虫及马圆形线虫三期幼虫并分析其生物学功能。结果：AC-chi6195基因全长1 453 bp,有2个内含子序列，共编码398个氨基酸，AC-chi6195属于糖基水解酶18家族且三级结构为典型的几丁质酶三磷酸异构酶桶形结构；遗传进化分析显示其与少孢节丛孢菌XJ-A1株几丁质酶AO-379亲缘关系相对最近；SDS-PAGE分析显示，重组蛋白AC-chi6195分子质量约为42 kDa;采用Ni柱层析法结合Western blot检测显示，获得了纯化的目的蛋白；DNS还原糖法检测显示，该重组几丁质酶活性为102 U/mg;酶学特性分析显示，该酶的最适反应条件为pH=7,40℃,1,4-二硫代苏糖醇（DTT）、SDS、Cu²⁺对其有抑制作用，该酶可降解胶体几丁质和少量壳聚糖；用重组几丁质酶AC-chi6195分别处理秀丽隐杆线虫和马圆形线虫三期幼虫12、24、36 h后，秀丽隐杆线虫死亡率分别为65%、93%、100%,马圆形线虫三期幼虫死亡率分别为75%、97%、100%。本研究结果为捕食性真菌高效杀线虫酶制剂的研发提供了依据。

关键词

圆锥节丛孢菌 / 几丁质酶 / 酶学特性 / 生物学活性