布氏杆菌分泌蛋白BspD真核表达载体的构建及在小鼠巨噬细胞中的表达

摘要

旨在构建布氏杆菌分泌蛋白BspD基因的真核表达载体，研究其在小鼠巨噬细胞RAW 264.7中的表达情况。根据GenBank公布的牛种布氏杆菌2308 bspD基因序列进行合成和设计特异性引物，通过PCR获得bspD基因片段，并将其克隆至pcDNA3.1-EGFP载体，获得真核表达载体pcDNA3.1-EGFP-bspD;pcDNA3.1-EGFP-bspD经酶切和测序分析鉴定后，用Lipofectamine 3000脂质体转染至小鼠巨噬细胞RAW 264.7,采用Western blot检测BspD蛋白在RAW 264.7细胞的表达，用ELISA试剂盒检测细胞上清中细胞因子γ-干扰素(IFN-γ)和白细胞介素-4(IL-4)的分泌水平，利用水溶性四唑盐-1(WST-1)细胞毒性检测试剂盒检测细胞毒性水平，利用细胞活力检测试剂盒-8(CCK-8)检测细胞增殖情况，利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测细胞凋亡基因Caspase-3和Caspase-8的表达水平。结果：阳性克隆载体经PCR扩增出936 bp的bspD基因片段，经限制性内切酶KpnⅠ和BamHⅠ酶切验证正确，测序分析显示与GenBank公布的序列信息同源性为100%,表明真核表达载体pcDNA3.1-EGFP-bspD构建成功；Western blot检测结果为pcDNA3.1-EGFP-bspD转染组在36 kDa处出现条带，与预期结果相符，表明BspD蛋白能够在RAW 264.7细胞中表达；细胞因子检测结果显示，BspD蛋白可诱导RAW 264.7细胞分泌辅助型T细胞1(Th1)型细胞因子IFN-γ和辅助型T细胞2(Th2)型细胞因子IL-4;细胞毒性检测结果显示，BspD蛋白对细胞无毒性，BspD蛋白对细胞增殖和Caspase-3和Caspase-8的表达无显著影响。综上，布氏杆菌分泌蛋白BspD能够在RAW 264.7细胞中表达，为进一步研究其功能及分子机制提供参考。

关键词

布氏杆菌 / BspD蛋白 / 真核表达 / 巨噬细胞