牛病毒性腹泻病毒1c型NS3解旋酶结构域蛋白原核表达及间接ELISA的建立

摘要

旨在建立NS3解旋酶结构域蛋白间接ELISA检测方法，为牛病毒性腹泻病毒（BVDV）血清学检测提供简便高效的方法。PCR扩增获得编码NS3解旋酶结构域基因，构建原核表达载体pET28a-BVDV1c-NS3-H; 1 mmol/L IPTG 25℃诱导表达目的蛋白后，采用Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白并通过Western blot验证其与阳性血清的特异性反应;之后采用纯化的NS3解旋酶结构域蛋白建立间接ELISA方法，进行了特异性、敏感性和重复性检验，并对不同地区的288份临床牛血清样品进行了检测，与IDEXX公司BVDV抗原试剂盒检测结果进行比较，确定符合率。结果:成功表达并纯化出NS3解旋结构域并证实其具有反应原性; ELISA优化结果表明，NS3解旋酶结构域蛋白最佳抗原包被浓度为1.25μg/m L，最佳包被液为1×TBST，最佳血清稀释浓度比为1∶10，最佳酶标二抗稀释浓度比为1∶10 000;阴阳性结果判定值OD_{450 nm}为0.087 87;该抗原与小反刍兽疫病毒阳性血清、口蹄疫病毒阳性血清、牛传染性鼻气管炎阳性血清均不发生交叉性反应，敏感性高达1∶12 800，批次内与批次间的变异系数均小于10%，并且对不同来源的牛血清样品进行检测，其符合率为85.74%。结论:本研究建立的NS3解旋酶结构域蛋白的间接ELISA方法可用于BVDV抗体检测并为BVD诊断奠定了基础。

关键词

牛病毒性腹泻病毒 / NS3解旋结构域蛋白 / 抗原表位 / 原核表达 / ELISA