猪内源性逆转录病毒三重实时荧光定量PCR检测方法的建立

摘要

旨在建立同时检测猪内源性逆转录病毒（porcine endogenous retrovirus, PERV）3种亚型的多重荧光定量PCR方法。扩增PERV囊膜基因env,构建重组质粒pMD-PERV-A、pMD-PERV-B、pUC-PERV-C作为标准品，建立了三重实时荧光定量PCR（RT-qPCR）方法标准曲线，并对该方法进行特异性、敏感性及重复性试验验证。结果：重组质粒标准品的拷贝数与Ct值呈良好的线性关系，PERV-A、PERV-B和PERV-C分别为：y=-3.363x+39.923,R²=0.993,扩增效率（E）=98.3%;y=-3.546x+41.090,R²=0.997,E=91.4%;y=-3.559x+40.618,R²=0.998,E=91%。特异性试验结果显示该方法能特异性检测PERV,而对猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒均无交叉反应；三重RT-qPCR敏感性均可达到1×10～2 copies/μL;批内及批间重复性试验变异系数均小于2%。使用该方法对107份五指山猪组织样品进行临床样品的检测，经过与传统检测方法进行对比，PERV-A、PERV-B、PERV-C阳性符合率分别为100%、100%、97.5%。综上，本试验所建立的检测方法能够同时定量分析PERV-A、PERV-B、PERV-C这3种亚型，且有较高的检测效率，能够为异种移植供体筛选提供前期的技术支持。

关键词

猪内源性逆转录病毒 / 囊膜基因 / 荧光定量PCR / TaqMan探针