单增李斯特菌谷胱甘肽过氧化物酶报告系统的构建及其调控因子筛选

摘要

旨在构建单增李斯特菌(LM)谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的绿色荧光蛋白(GFP)报告系统，筛选GSH-Px的调控因子，并验证调控因子对LM生长能力和抗氧化应激能力的影响。通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)方法，构建携带gsh-px启动子区域的gfp报告质粒pFL516;通过测定携带报告质粒的亲本株10403S-pFL516荧光蛋白表达情况来验证报告质粒pFL516是否构建成功；通过测定报告质粒pFL516在亲本株10403S和各双元调控系统缺失株里的转录水平来筛选GSH-Px的调控因子；生长曲线检测该调控因子缺失对LM生长能力的影响；通过氧化应激存活试验，测定该调控因子缺失对LM抗氧化应激能力的影响。结果：PCR检测显示报告质粒pFL516成功构建并电转入14对双元调控系统缺失株，其中7对双元调控系统的缺失导致gsh-px基因转录水平上调，6对双元调控系统的缺失则导致gsh-px基因转录水平下调，1对双元调控系统缺失后gsh-px的转录水平无显著差异。选取双元调控系统lmo1508/lmo1509进一步研究发现，在非胁迫和金属离子胁迫条件下双元调控系统lmo1508/lmo1509缺失株的gsh-px转录水平显著高于亲本株10403S,说明lmo1508/lmo1509负调控gsh-px的转录水平；生长曲线结果表明lmo1508/lmo1509基因缺失不影响10403S菌株的生长能力，应激存活试验结果表明，lmo1508/lmo1509缺失显著降低LM在氧化应激条件下的存活率，表明lmo1508/lmo1509对LM的抗氧化应激能力存在正调控。结果表明，在LM中成功构建gsh-px的报告系统，并筛选出调控gsh-px的调控因子lmo1508/lmo1509,为深入了解双元调控系统与LM抗氧化酶GSH-Px之间的调控关系提供了重要的研究工具。

关键词

单增李斯特菌 / 谷胱甘肽过氧化物酶 / 报告系统 / 调控因子