牛副流感病毒3型NP蛋白在昆虫杆状病毒系统中的表达

摘要

为表达牛副流感病毒3型（BPIV3）核衣壳蛋白（NP），利用昆虫表达系统构建p Fast BAC-NP重组质粒，经转座获得重组杆粒BacmidNP，转染昆虫细胞（Sf9）后获得重组杆状病毒。通过Bacmid-NP感染Sf9细胞表达NP蛋白，利用高浓度咪唑洗脱纯化NP蛋白，利用半数组织培养感染剂量(TCID₅₀)测定病毒滴度，SDS-PAGE和Western blot分析NP蛋白的纯化效果，BCA测定蛋白浓度，并将蛋白免疫小鼠，检测免疫后抗体水平。结果:构建的Bacmid-NP采用pUC/M13通用引物验证，证实NP基因成功克隆至Bacmid杆粒; P3代重组病毒的TCID₅₀为10^-6.86/0.1 m L; Bacmid-NP传代后Western blot检测，可在67 ku出现特异性条带;通过SDS-PAGE对感染Bacmid-NP的Sf9细胞进行检测，结果表明上清液与沉淀均可表达; Western blot鉴定结果表明67 ku左右有特异性反应条带，说明NP蛋白可以分泌表达;采用镍柱纯化，SDS-PAGE鉴定纯化效果，并将纯化蛋白与BPIV3阳性血清进行Western blot试验，结果显示纯化蛋白为单条带，可以与阳性血清特异性结合，蛋白浓度为0.596 mg/m L，免疫小鼠后血清效价可达1∶64 000。综上，本试验利用昆虫表达系统成功表达了NP蛋白，为进一步建立检测方法和疫苗研制提供了技术基础。

关键词

牛副流感病毒3型 / 杆状病毒表达系统 / NP蛋白