布氏杆菌TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

摘要

旨在建立布氏杆菌TaqMan实时荧光定量PCR（qPCR）检测方法。以布氏杆菌高度保守的单拷贝基因bcsp31作为靶基因，设计特异性引物及Taq Man探针，优化反应体系和反应条件，建立标准曲线，通过特异性试验、灵敏性试验、重复性试验及其与商品化试剂盒的检测效果比对验证本方法的优势，并应用本方法对猪布病进行了检测。应用Taq Man q PCR反应的最优条件，建立了本方法的标准曲线，y=-3.364lg x+48.740,R²=1.000。本方法对布氏杆菌表现出高度的特异性，与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、猪链球菌、沙门菌及副猪格拉菌等常见病原体均无交叉反应，可实现布氏杆菌的精准鉴别;最低检测限度为1×10～1拷贝/μL，是普通PCR的100倍;批内及批间重复的变异系数均小于2%。与商品化试剂盒的检测效果相比，本方法在低浓度模板的检测中更有优势。应用本方法对猪临床样本（683份淋巴结和341份生殖拭子）中布氏杆菌进行检测，结果显示猪淋巴结样本的阳性检出率为1.17%，生殖拭子样本的阳性检出率为1.47%，均稍高于商品化荧光检测试剂盒的阳性检出率。综上所述，本研究建立的布氏杆菌TaqMan q PCR方法灵敏、特异、稳定，适用于动物布病的快速监测和早期诊断。

关键词

布氏杆菌 / 实时荧光定量PCR / 猪布病检测 / 应用

基金资助

山东省重点研发计划(重大科技创新工程)课题(2022CXGC020711-4); 山东省生猪产业技术体系项目(SDAIT-08); 山东省农业科学院创新工程项目(CXGC2025A04、CXGC2025C10); 济南市新高校20条(202333065)项目; 泰山学者工程项目