CSFV/PRV三重荧光定量PCR与PRV双重微滴式数字PCR检测方法的建立及性能比较

摘要

猪瘟病毒（CSFV）与伪狂犬病病毒（PRV）监测是猪场疫病防控的重要手段，本研究旨在建立CSFV、PRV三重荧光定量PCR（qPCR）与PRV双重微滴式数字PCR（ddPCR）方法并进行比较。针对CSFV E2、PRV g E和PRV g H基因序列的保守区域设计用于构建三重qPCR体系的特异性引物和探针，对构建的三重qPCR检测方法进行优化，建立标准曲线并进行敏感性、特异性和重复性试验。结果显示，该三重qPCR方法标准曲线相关系数（R²）均大于0.99，对PRV g E基因的最低检测限为100 copies/μL，对CSFV E2和PRV g H的最低检测限为10 copies/μL，对常见猪病病原及健康猪样品检测结果均为阴性，组内与组间变异系数（CV）均小于5%，表现出良好的敏感性、特异性和重复性。使用该方法对235份组织样品和35份全血样品进行检测，CSFV和PRV检测结果与国标检测方法的符合率分别为98.7%（232/235）和100%（80/80）。基于上述PRV引物探针建立了双重ddPCR方法并制备配套的核酸对照品PRV-DNA-RM与PRV-Δg E-DNA-RM，对其定值分别为（911.34±42.92）和（1 280.8±94.4）copies/μL; 2种核酸对照品的稳定性评估显示，其在4℃及更低温中可稳定保存14 d以上，在37℃可稳定保存至少7 d。采用20、10、5和1 copies/μL的核酸对照品对所建立的qPCR和ddPCR方法进行了比较，qPCR方法在检测通量及检测时长上更有优势，而ddPCR方法对低拷贝数（≤5 copies）的样品检测更为灵敏。综上，本研究成功建立了可同时检测CSFV E2、PRV g E和PRV g H基因的qPCR和ddPCR方法及两种PRV核酸对照品，可广泛用于PRV的核酸检测、疫苗特异性鉴定及检测方法的质量控制。

关键词

猪瘟病毒 / 伪狂犬病病毒 / 多重荧光定量PCR / 微滴式数字PCR

基金资助

国家重点研发计划项目(2022YFD1800805,2022YFD1800605)