猪肺炎支原体截短融合蛋白P46-P97-P65的表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

摘要

旨在建立一种检测猪肺炎支原体(Mhp)抗体的方法。选取Mhp P46、P97和P65的截短蛋白作为抗原，不同抗原之间用柔性连接肽Linker (GGGGS)将3个片段进行连接，构建重组质粒p ET28-Mhp-P46-P97-P65，对该质粒进行双酶切鉴定，确认结果无误后，将其转化至BL21 (DE3)感受态细胞，诱导表达后获得可溶性表达的Mhp-P46-P97-P65截短融合蛋白。以纯化的Mhp-P46-P97-P65截短融合蛋白为包被抗原，优化各项反应条件，初步建立了间接ELISA抗体检测方法。优化结果显示:ELISA方法的抗原包被浓度为1.0μg/mL，待检血清1∶50稀释;羊抗猪Ig G-HRP抗体使用浓度为1∶1 000，临界值为0.250。该方法具有较高的特异性，与猪丹毒杆菌(Er)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)等病原抗体无交叉反应;批内和批间变异系数均低于10%，表现出良好的重复性。采用本研究建立方法和IDEXX公司Mhp抗体ELISA试剂盒对比检测217份临床血清，结果显示，Mhp ELISA阳性率为47%(102/217)，阴性率53%(115/217); IDEXX ELISA阳性率为54.84%(119/217)，阴性率45.16%(98/217)，两者的阳性符合率为80.67%，阴性符合率为93.88%，总符合率为86.64%。上述结果表明，本研究所建立的Mhp ELISA方法检测结果准确可靠，具有很好的应用前景。

关键词

猪肺炎支原体 / 融合蛋白 / P46 / P97 / P65 / 间接ELISA

基金资助

湖南省重点研发计划项目(2023NK2017)