芦荟大黄素通过血小板凝血酶蛋白-1-PI3k-Akt通路抑制瘢痕组织纤维化的研究

Aloe-emodin inhibits scar tissue fibrosis through thrombospondin-1-PI3k-Akt pathway

摘要

目的 探讨芦荟大黄素通过血小板凝血酶蛋白-1（THBS1）—磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）—蛋白激酶B（Akt）抑制瘢痕组织纤维化的机制。 方法 对人腭裂术后瘢痕组织来源成纤维细胞进行培养，采用不同浓度（10、20、30、40、50 μmol/L）芦荟大黄素作用于该细胞并检测其细胞活性，同时对瘢痕组织及细胞进行转录组测序，采用生物信息学方法挖掘瘢痕组织纤维化的潜在靶点及信号通路。 结果 芦荟大黄素对成纤维细胞增殖有抑制作用，其中40 μmol/L浓度组最明显；瘢痕组织及细胞测序结果提示，差异基因在细胞外基质与受体相互作用通路中显著富集，且组织与细胞拥有共同差异基因THBS1；过表达分析结果提示，差异基因THBS1在PI3K-Akt信号通路中显著富集。 结论 芦荟大黄素可能通过下调THBS1，抑制PI3K-Akt通路，从而降低术后腭部瘢痕组织来源的成纤维细胞增殖活性。

Abstract

Objective To propose a hypothesis that aloe-emodin may inhibit scar tissue fibrosis through thrombospondin-1(THBS1)-PI3K-Akt pathway. Methods By cultivating fibroblasts derived from scar tissue after cleft palate surgery in humans, aloe emodin of different concentrations (10, 20, 30, 40 and 50 μmol/L) was added to the cells which activity was detected. At the same time, transcriptome sequencing was performed on scar tissue and cells, and bioinformatics methods were used to explore potential targets and signaling pathways of scar tissue fibrosis. Results Aloe-emodin had a concentration dependent inhibitory effect on fibroblast proliferation,with the 40 μmol/L concentration group showing the most significant effect. The results of tissue and cell sequencing indicated that differentially expressed genes were significantly enriched in extracellular matrix-receptor interaction pathway, and shared a common differential gene which was THBS1. The ORA analysis results indicated that differentially expressed genes, including THBS1, were significantly enriched in the PI3K-Akt signaling pathway. Conclusion Aloe emodin may inhibit the PI3K-Akt pathway by downregulating THBS1, thereby reducing the proliferation activity of fibroblasts derived from postoperative palatal scar tissue.

Graphical abstract

关键词

芦荟大黄素 / 血小板凝血酶蛋白-1 / PI3K-Akt信号通路 / 纤维化 / 腭部瘢痕

Key words

aloe-emodin / thrombospondin-1 / PI3K-Akt signaling pathway / fibrosis / palatal scar

唇腭裂是口腔颌面部最常见的先天发育异常性疾病^[1]，手术仍是其主要治疗手段。然而，术后患儿常继发上颌骨发育不足，严重影响身心健康^[2]，研究^[3]表明，瘢痕组织的形成是导致患儿上颌骨发育异常的关键因素之一。组织纤维化是瘢痕形成的重要原因，因此，抑制组织纤维化对改善腭裂术后瘢痕形成显得尤为重要。

本研究对人腭裂瘢痕组织来源成纤维细胞进行培养，探究芦荟大黄素对该细胞增殖是否存在影响，并结合生物信息学方法期望为后续机制研究提供一种相对合理的假设。

1 材料和方法

1.1 瘢痕组织转录组测序

选取3例腭裂二期手术患者瘢痕及周围正常组织样本进行转录组学测序，已获石家庄市妇幼保健院伦理委员会批准［批准号：（2023）0601］。筛选差异基因标准：差异基因倍数>2，校正P值（Padj）<0.05，使用R工具包DEseq2软件进行分析。

1.2 瘢痕组织来源成纤维细胞培养及鉴定

将上述人腭裂术后瘢痕组织来源成纤维细胞进行培养，采用组织块培养法，剥离上皮组织保留结缔组织行原代细胞培养，并按照1∶3比例传代培养。选取第3代培养细胞行免疫细胞化学染色鉴定，分别加入抗波形蛋白（浓度1∶800）及抗角形蛋白（浓度1∶800）。

1.3 细胞增殖活力浓度检测

将芦荟大黄素按照不同浓度分为5组，分别为10、20、30、40、50 μmol/L，另设一空白对照组，将其分别加入成纤维细胞中，采用细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK8）法检测各组细胞的活力情况。使用酶标仪测定在波长450 nm处各孔光密度值（optical density，OD）以计算6组活细胞的数量。

1.4 细胞转录组测序

随机选取3瓶细胞样本进行转录组测序，实验组为加入40 μmol/L浓度芦荟大黄素处理的成纤维细胞，对照组为成纤维细胞空白对照。

1.5 实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）检测血小板凝血酶蛋白-1（thrombospondin-1，THBS1）相对表达量

采用qPCR法分别检测瘢痕组织与正常组织，40 μmol/L浓度芦荟大黄素处理的成纤维细胞与空白对照成纤维细胞中RNA相对表达量。

1.6 组织测序KEGG富集分析

根据瘢痕组织与正常组织测序所确定的差异基因情况行富集分析，探寻通路。富集分析采用超几何分布算法，使用聚类分析与功能富集分析工具包（clusterProfiler）进行分析。

1.7 细胞测序富集分析

根据芦荟大黄素处理的成纤维细胞与阴性对照成纤维细胞测序所确定的差异基因情况行富集分析，探寻通路。富集分析采用超几何分布算法，使用R包 clusterProfiler进行分析。

1.8 蛋白质免疫印迹（western blotting，WB）法检测人腭裂术后腭部瘢痕组织来源的成纤维细胞中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白的表达

采用WB法分别检测加入50 μmol/L的LY294-002（PI3K抑制剂）或40 μmol/L的芦荟大黄素处理的成纤维细胞与空白对照成纤维细胞中蛋白相对表达量。

加药24 h后，提取并收集总蛋白，测定其浓度。蛋白样品在10%的凝胶中分离后转膜。室温下用5%脱脂奶粉封闭2 h，加入PI3K（1∶1000）、p-PI3K（1∶1000）、Akt（1∶1000）、p-Akt（1∶1000）、β-肌动蛋白（β-actin）（1∶8000）的特异性一抗，4 ℃孵育过夜，次日加入山羊抗兔二抗（1∶5000），室温孵育1 h。使用增强化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）底物进行蛋白检测，条带强度通过ImageJ软件进行分析。

2 结果

2.1 组织测序差异基因

瘢痕组织与正常黏膜组织测序所得部分差异基因显示THBS1在瘢痕组织中高表达，在周围正常组织中低表达，见图1。

2.2 细胞培养

成功培养人腭裂术后腭部瘢痕组织来源的原代及传代成纤维细胞，见图2。显微镜下可见：有少许长梭形细胞由组织块周围放射状离散出来，渐成晕状。成纤维细胞呈现长梭形或放射星形，细胞胞浆丰满，有2~4个不等的胞浆突，细胞核大多为1个且为椭圆形，细胞紧贴培养瓶壁爬行生长。细胞较少密度低时细胞间呈网状，细胞密度高时则排成旋涡状或者束状。同时给予细胞鉴定，传代细胞抗波形蛋白染色阳性，抗角形蛋白染色阴性，符合结缔组织中成纤维样细胞，见图3。

2.3 分组比较细胞增殖活性

CCK8法细胞增殖浓度检测结果见图4，5个实验组与对照组间均存在统计学差异（P<0.001），其中40 μmol/L组OD值最小（P<0.01）。

2.4 细胞测序差异基因

40 μmol/L浓度芦荟大黄素处理的成纤维细胞与空白对照成纤维细胞进行测序所得部分差异基因显示THBS1在40 μmol/L浓度组中低表达，而在空白对照组中高表达，见图5。

2.5 THBS1基因表达情况

THBS1基因在RNA水平相对表达情况见图6，瘢痕组织与正常组织中THBS1表达差异有统计学意义，40 μmol/L浓度芦荟大黄素处理的成纤维细胞与空白对照成纤维细胞中THBS1表达差异有统计学意义。

2.6 组织测序富集分析

组织测序富集分析结果见图7~8，差异基因在细胞外基质与受体相互作用［extracellular matrix（ECM）-receptor interaction］通路中显著富集，ECM-receptor interaction通路中有25个差异基因富集。

2.7 细胞测序富集分析

细胞测序富集分析结果差异基因在PI-3K-Akt信号通路和ECM-receptor interaction信号通路中显著富集，PI3K-Akt信号通路富集到38个差异基因，ECM-receptor interaction信号通路富集到15个差异基因，见图9~10。

2.8 芦荟大黄素抑制PI3K/Akt信号通路

p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白水平相对表达情况，见图11。

与空白对照成纤维细胞相比，加入50 μmol/L LY294002（PI3K抑制剂）或加入40 μmol/L芦荟大黄素的成纤维细胞，PI3K及Akt的磷酸化蛋白的表达水平均降低。

3 讨论

组织纤维化的过程涉及成纤维细胞增殖和细胞外基质积聚：包括转化生长因子、血小板源性生长因子、内皮细胞生长因子、纤维母细胞生长因子等生长因子和促纤维化细胞因子如白细胞介素-1和肿瘤转化生长因子在内的多种因子可促进成纤维细胞向损伤部位迁移和增殖，继而合成分泌以胶原为主的ECM并在细胞外积聚，促进组织纤维化。随着伤口愈合，白细胞和成纤维细胞进一步合成并分泌以上促纤维化因子，促进胶原合成与细胞外积聚^[4]，加剧组织纤维化。因此，成纤维细胞在组织纤维化中起到核心作用^[5-6]。

越来越多的证据表明，来源于某些植物的天然化合物成分能够抑制成纤维细胞增殖，发挥抗组织纤维化的作用。例如，β-谷甾醇能抑制皮肤增生性瘢痕成纤维细胞增殖^[7]，川芎嗪可抑制皮肤增生性瘢痕成纤维细胞的增殖并下调相关促纤维化因子的表达^[8]，人参皂苷Rg3既可抑制皮肤增生性瘢痕成纤维细胞增殖，同时一定程度上抑制部分ECM的沉积^[9]。综上，药理抑制成纤维细胞可发挥抗组织纤维化及瘢痕组织形成的作用，从而为继发性上颌发育不足的治疗提供丰富的治疗思路。

3.1 芦荟大黄素对人腭裂术后瘢痕成纤维细胞增殖产生抑制

芦荟大黄素是一种天然蒽醌类化合物，具有多种药理作用，包括抗癌、抗病毒、抗炎、抗菌、抗寄生虫、神经保护和肝脏保护等作用^[10]。张培华等^[11]发现芦荟大黄素以剂量、时间依赖性的方式对人皮肤增生性瘢痕来源的成纤维细胞（human hypertrophic scar derived fibroblasts，hHSFs）生长起到抑制作用。Dou等^[12]发现芦荟大黄素可以降低小鼠肾纤维化相关蛋白的水平。也有报道^[13-15]显示，以芦荟大黄素为主要成分的中药合剂可对肝、肾纤维化起到改善作用。本实验对人腭裂术后腭部瘢痕组织来源的成纤维细胞进行培养（图2~3），结果表明芦荟大黄素对成纤维细胞增殖的抑制作用呈浓度依赖性，其中40 μmol/L浓度组抑制最明显（图4）。然而，芦荟大黄素抑制成纤维细胞增殖并发挥抗瘢痕组织形成的作用及相关分子机制仍需进一步阐明。

3.2 芦荟大黄素下调THBS1的表达，抑制腭部组织纤维化

THBS1是一种细胞外基质蛋白，在肿瘤发生、纤维化、白细胞募集等过程中发挥重要作用^[16]。Bige等^[17]认为THBS1是肾脏疾病重要的促纤维化和炎症介质。THBS1结合并激活TGF-β1促进肝、肾纤维化^[18-20]，也可以通过激活成人心脏组织中TGF-β1并促进基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的表达，从而导致心肌重塑和纤维化^[21]。研究^[22]表明，抑制THBS1的表达可有效预防肺纤维化。Zhou等^[23]利用miR-221靶向THBS1，从而抑制TGF-β1，改善肾功能衰竭所致的心肌纤维化。同样，Asama等^[24]利用let-7d靶向THBS1来抑制人多能干细胞（human pluripotent stem cells，hPSC）的激活，进而调节胰腺纤维化。Jiang等^[25]通过阻断THBS1下调TGF-β1/Smad3信号通路进而减轻高糖诱导下的腹膜纤维化。还有研究^[26]表明，THBS1是隐性营养不良型大疱性表皮松解症（recessive dystrophic epidermolysis bullosa，RDEB）成纤维细胞TGF-β信号的主要激活物，即THBS1可能是降低RDEB患者纤维化的有效靶点。然而THBS1在口腔相关疾病或瘢痕组织形成导致上颌发育不足的相关领域仍然缺乏相关研究，因此亟待阐明THBS1在相关领域的作用及机制。

通过对3例患者瘢痕组织和周围正常组织进行转录组测序，我们发现，瘢痕组织中THBS1表达显著高于正常组织（图1）。同样，利用40 μmol/L浓度芦荟大黄素处理腭裂术后瘢痕组织来源的成纤维细胞并进行转录组学分析，结果显示芦荟大黄素可显著下调THBS1的表达（图5）。上述结果提示THBS1可能在纤维化所致的口腔上颌发育不足过程中发挥关键作用。同上述转录组测序结果一致，利用qPCR检测THBS1的表达量，结果显示芦荟大黄素可显著下调THBS1的表达（图6）。

3.3 THBS1-PI3K-Akt促进腭部瘢痕成纤维细胞增殖

THBS1通过与纤维蛋白原、纤维连接蛋白、层粘连蛋白、Ｖ型胶原、整合素、CD47及CD36等结合，从而介导细胞与细胞、细胞与ECM之间的相互作用，进而影响细胞功能^[27-28]。PI3K/Akt信号通路是调控细胞生长、增殖、迁移、代谢和存活的核心通路之一^[29]，可通过激活参与细胞周期转换和细胞增殖的下游效应分子，在调节多种生理过程中发挥重要作用^[30]。越来越多的研究^[31-35]表明该信号通路与组织纤维化过程高度相关。有报道^[31]显示，PI3K/Akt在内质网应激的上游发挥作用，影响肺成纤维细胞的增殖，促进博来霉素诱导的肺纤维化。一些促纤维化因子，如α平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和TGF-β均可激活PI3K/Akt，促进肺纤维化的形成^[32-33]。其中，TGF-β激活PI3K诱导Akt磷酸化，抑制Akt可显著缓解由压力超负荷引起的心肌纤维化^[34]。Xu等^[35]发现THBS1的选择性拮抗剂LSKL，可抑制PI3K/Akt从而抑制hHSFs的增殖，促进细胞凋亡，改善了机械拉伸诱导的大鼠尾部皮肤增生性瘢痕。综上，THBS1-PI3K-Akt在纤维化过程中发挥着重要作用，因此抑制THBS1-PI3K-Akt可能发挥抗纤维化及瘢痕组织形成的作用。

有报道^[36]显示，大黄素可通过抑制THBS1表达从而改善大鼠肾纤维化。Dou等^[12]通过体内及体外实验发现芦荟大黄素可以通过抑制PI3K/Akt信号通路改善小鼠肾纤维化。还有研究^[37]表明，大黄素能通过调控PI3K/Akt信号通路，改善非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝脏脂质沉积，减轻炎症细胞浸润，改善肝脏纤维化病变。以芦荟大黄素为主要成分的复方中药合剂通过网络药理学及转录组学分析，发现可能通过PI3K/Akt等一些通路发挥抗纤维化作用^[13,38-39]。

对瘢痕组织及成纤维细胞转录组测序结果进行KEGG富集分析，结果均显示，差异基因在ECM-receptor interaction通路中显著富集，且拥有共同差异基因THBS1（图7~10）。ORA分析结果提示，包括THBS1在内的差异基因在PI3K-Akt信号通路中显著富集（图9~10），提示THBS1可能通过与受体相互作用激活PI3K-Akt，从而促进成纤维细胞增殖及腭部瘢痕形成。据此可提出假设：芦荟大黄素可能通过下调THBS1，抑制PI3K-Akt，从而降低术后腭部瘢痕组织来源的成纤维细胞增殖活性，发挥抗腭部组织纤维化及瘢痕形成的作用（图12）。

本研究期望通过以上基础研究结果，为后续机制探究提出一种相对合理假设，有望为腭裂瘢痕治疗提供一个新的靶点——THBS1，为临床治疗提供一种新的药物选择——芦荟大黄素。

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基金资助

河北省医学科学研究课题计划(20240510)