龈沟液中细胞外游离DNA与牙周临床指标及环磷酸鸟苷—磷酸腺苷合成酶—干扰素基因刺激因子信号通路相关分子的关联性分析

Correlation analysis of cell-free DNA in gingival crevicular fluid with periodontal clinical indicators and cyclic guanosine phosphate-adenosine phosphate synthase-stimulator of interferon genes signaling pathway

摘要

目的 探究龈沟液（GCF）中细胞外游离DNA（cfDNA）与牙周临床指标、牙龈组织及牙龈成纤维细胞（HGFs）表达DNA感受通路环磷酸鸟苷—磷酸腺苷合成酶（cGAS）—干扰素基因刺激因子（STING）的可能关联。 方法 收集健康者和牙周炎患者的GCF及牙龈组织，记录受试者全口牙周临床指标，包括菌斑指数（PLI）、出血指数（BI）、探诊深度（PD）、临床附着水平（CAL），定量龈沟液cfDNA浓度，分析其与牙周临床指标的相关性；采用免疫荧光、定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）分别检测牙龈组织中cGAS、STING、p-STING的分布，以及cGAS-STING信号通路关键分子cGAS、STING、抑制因子激酶（IKK）、核因子κB p65（NF-κB p65）、白细胞介素（IL）-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）mRNA的表达。应用健康组及牙周炎组GCF来源的cfDNA刺激HGFs，通过Western blot及RT-qPCR检测细胞cGAS-STING信号通路关键分子的表达。 结果 牙周炎组GCF中cfDNA水平显著高于健康组，且cfDNA水平与牙周临床指标呈强正相关性。与健康组相比，牙周炎组牙龈组织中cGAS、STING、p-STING与HGFs标志物FSP-1的荧光共定位百分比显著增加，牙周炎组牙龈组织中cGAS、STING、IKK、NF-κB p65、IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表达水平高于对照组；与对照组相比，健康组或牙周炎组GCF来源cfDNA体外刺激HGFs后，cGAS和p-STING的蛋白表达水平呈升高趋势，cGAS、STING、IKK、NF-κB p65、IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表达水平均显著增高。相关性分析显示：牙龈组织取样位点cfDNA浓度与cGAS、STING、NF-κB p65、IL-6的mRNA表达呈正相关性。 结论 牙周炎患者GCF中cfDNA水平显著升高，且可能通过激活HGFs的cGAS-STING信号通路在牙周炎进展中发挥重要作用。

Abstract

Objective This study aims to explore the potential relationships of cell-free DNA (cfDNA) in gingival crevicular fluid (GCF) with periodontal clinical indicators and the expression of DNA receptor pathway cyclic guanosine phosphate-adenosine phosphate synthase (cGAS)-stimulator of interferon genes (STING) in gingival tissues and human gingival fibroblasts (HGFs). Methods GCF and gingival tissue samples were collected from periodontally healthy individuals and patients diagnosed with periodontitis. Periodontal clinical indicators were recorded, including plaque index (PLT), bleeding index (BI), probing depth (PD), and clinical attachment level (CAL). The concentration of cfDNA in GCF was quantified, and the correlation between GCF and periodontal clinical indicators was analyzed. Immunofluorescence and reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) were used to assess the distribution of cGAS, STING, and p-STING in gingival tissues. Additionally, the mRNA expression levels of the key components of the cGAS-STING signaling pathway, namely, cGAS, STING, inhibitory of kappa-B kinase (IKK), nuclear factor kappa-B p65 (NF-κB p65), interleukin (IL)-1β, IL-6, and tumor necrosis factor-α (TNF-α), were measured. Furthermore, cfDNA extracted from GCF was employed to stimulate HGFs in the healthy control and periodontitis groups, and the mRNA expression levels of the key molecules of cGAS-STING signaling pathway were detected through Western blot and RT-qPCR. Results The concentration of cfDNA in GCF was found to be significantly elevated in the periodontitis group compared with the control group. Moreover, cfDNA concentration demonstrated a strong positive correlation with the periodontal clinical indicators. Immunofluorescence analysis revealed considerably increased percentage of fluorescence co-localization of cGAS, STING, and p-STING with the gingival fibroblast FSP-1 marker in the gingival tissues of the periodontitis group. The mRNA expression levels of cGAS, STING, IKK, NF-κB p65, IL-1β, IL-6,and TNF-α were significantly higher in the periodontitis group. In vitro stimulation of HGFs with GCF-derived cfDNA resulted in increased protein expression of cGAS and p-STING and considerably upregulated the mRNA expression levels of cGAS, STING, IKK, NF-κB p65, IL-1β, IL-6, and TNF-α in the healthy and periodontitis groups compared with the blank group. Correlation analysis showed that the concentration of cfDNA at the sampling site was positively correlated with the mRNA expression levels of cGAS, STING, NF-κB p65, and IL-6 in gingival tissues. Conclusion cfDNA concentrations in the GCF of patients with periodontitis are considerably elevated, and are associated with the activation of the cGAS-STING signaling pathway in HGFs. These findings suggest that cfDNA contributes to the progression of periodontitis.

Graphical abstract

关键词

牙周炎 / 细胞外游离DNA / 环磷酸鸟苷—磷酸腺苷合成酶—干扰素基因刺激因子信号通路 / 人牙龈成纤维细胞

Key words

periodontitis / cell-free DNA / cyclic guanosine phosphate-adenosine phosphate synthase-stimulator of interferon genes signaling pathway / human gingival fibroblasts

牙周炎是一种导致牙周支持组织破坏的慢性感染性疾病，先天免疫反应在牙周炎的发生发展中发挥重要作用^[1]。先天免疫反应的启动依赖模式识别受体与病原相关分子模式或损伤相关分子模式相互识别。当模式识别受体被分子模式激活后，能将信号转导至胞内进一步活化相关转录因子，使其入核激活下游基因转录，从而释放细胞因子等，发挥炎症级联放大的效应^[2-3]。

细胞外游离DNA（cell-free DNA，cfDNA）是指存在于体液中的游离DNA，可作为细胞外分子模式，激活包括环磷酸鸟苷—磷酸腺苷合成酶（cyclic guanosine phosphate-adenosine phosphate syn-thase，cGAS）、黑素瘤缺乏因子2（absent in melanoma 2，AIM2）、Toll样受体 9（Toll-like receptor 9，TLR9）等在内的多种核酸感受模式识别受体，与糖尿病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、冠心病等慢性免疫炎症性疾病具有直接关联^[4]。牙周炎症微环境中存在cfDNA，包括微生物基因组DNA（bDNA）和宿主细胞死亡裂解释放的DNA［细胞核DNA、线粒体DNA（mtDNA）、中性粒细胞胞外陷阱（neutrophil extracellular traps，NETs）等］^[5-7]。课题组前期研究^[8]发现：丝线结扎诱导的牙周炎小鼠模型中唾液和血清cfDNA水平显著升高，且出现明显的炎症性牙槽骨吸收；而牙周组织局部应用cfDNA清除剂G3^@SeHANs能够明显抑制牙周组织的免疫炎症反应，减轻小鼠牙槽骨吸收。提示：cfDNA作为一种核酸分子模式可能通过激活核酸感受模式识别受体，在牙周炎发生发展中扮演重要角色。

cGAS是一种胞质DNA传感器，其与干扰素基因刺激因子（stimulator of interferon genes，STING）结合，激活核因子κB p65（nuclear factor kappa-B p65，NF-κB p65），诱导促炎因子白细胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的产生^[9]。cGAS-STING信号通路最初是由于感知外源DNA并产生先天免疫反应被发现^[10]。Tumburu等^[11]发现镰状细胞病患者的cf-mtDNA升高，且患者血浆中高水平cf-mtDNA触发了NETs的形成，通过抑制TANK结合激酶1（The TANK-binding kinase 1，TBK1）可显著减少NETs，证明了cGAS-STING信号通路的参与。另有学者^[12]在干眼症研究中发现：应激状态可导致角膜上皮细胞的mtDNA通过线粒体通透性转换孔释放到细胞质中，激活cGAS-STING信号通路从而加重炎症反应和眼表损伤；而敲除或阻断STING基因、抑制mtDNA释放均可显著减少炎症反应及眼表损伤。在口腔医学领域，研究^[13]显示：不可复性牙髓炎患牙牙髓组织中cGAS和STING的 mRNA表达增加，而在人牙髓细胞中使用cGAS或STING抑制剂，可减轻由细菌DNA感染引起的干扰素β（interferon-β，IFN-β）、TNF、IL-6分泌。综上研究均提示：牙周炎患者龈下微环境中的cfDNA可能激活cGAS-STING信号通路，影响牙周组织局部免疫稳态平衡。然而，目前相关机制尚未被充分探讨。

本研究拟收集牙周健康者和牙周炎患者的龈沟液（gingival crevicular fluid，GCF）和牙龈组织，检测GCF中cfDNA浓度、牙龈组织中cGAS-STING信号通路的表达，并分析其与牙周临床指标等的相关性，使用牙周健康者和牙周炎患者GCF来源cfDNA刺激人牙龈成纤维细胞（human gingival fibroblasts，HGFs），检测HGFs细胞中cGAS-STING信号通路关键分子的表达，以期为丰富牙周炎先天免疫调节机制提供一定的实验依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和材料

血清/血浆游离DNA提取试剂盒［天根生化科技（北京）有限公司］，Quant-iT^TM PicoGreen^TM dsDNA定量试剂盒、兔源一抗cGAS、兔源一抗STING、兔源一抗p-STING、鼠源一抗成纤维细胞特异性蛋白1（fibroblast specific protein 1，FSP-1）、鼠源一抗CK14、羊抗兔荧光二抗AF488、羊抗鼠荧光二抗AF594、lipo3000（赛默飞公司，美国），DAPI、抗体稀释液、抗荧光衰减封片液、DMEM培养基、青霉素—链霉素溶液（北京索莱宝科技有限公司），SYBR Green qPCR Mastrer Mix试剂盒（APExBIO公司，美国），胎牛血清（Bio-sharp公司，加拿大），十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylami-de gelelectrophoresis，SDS-PAGE）凝胶电泳、无蛋白快速转膜液（上海雅酶生物医药科技有限公司），牙周探针UNC-15［豪孚迪医疗器械（上海）有限公司］，Whatman^®3MM色谱滤纸（Whatman 公司，美国）。

1.2 研究对象

根据2018年牙周病学新分类^[14]诊断标准筛选受试者。牙周健康者的诊断标准：无临床附着丧失，探诊出血（bleeding on probing，BOP）<10%且探诊深度（probing depth，PD）≤3 mm。Ⅲ~Ⅳ期牙周炎患者的诊断标准：1）PD≥6 mm，邻面临床附着丧失最重位点≥5 mm，垂直骨吸收≥3 mm，Ⅱ~Ⅲ度根分叉病变；2）影像学骨丧失至根中1/3或根尖1/3；3）因牙周炎失牙。

共纳入牙周健康者和Ⅲ~Ⅳ期牙周炎患者各10名。受试者的纳入标准：年龄18~40岁，口内至少有20颗恒牙和≥4颗磨牙。排除标准：1）吸烟史、酗酒史；2）不良咬合习惯；3）孕妇、哺乳期妇女；4）系统疾病；5）近6个月内接受过牙周治疗；6）近3个月服用过抗生素；7）正在接受正畸治疗。本研究经四川大学华西口腔医院伦理委员会批准（批件号：WCHSIRB-D-2019-057），所有患者均知情并签署知情同意书。

1.3 临床资料及样本的采集

受试者知情同意后，由同一名校准后的牙周专科医生记录受试者身高、体重，并使用UNC-15探针检查记录牙周临床指标^[15]，包括菌斑指数（plaque index，PLI）、出血指数（bleeding index，BI）、PD和临床附着水平（clinical attachment le-vel，CAL）。

牙周临床指标记录后，另行预约采集受试者GCF或牙龈组织。1）GCF：健康组取自4个象限第一磨牙近中颊侧无炎症、PD≤3 mm的位点，如第一磨牙缺失或有炎症，取第二磨牙或第一前磨牙近中颊侧位点；牙周炎患者取自4个象限PD最重的位点各1个。2）牙龈组织：健康组取自需行前牙美学牙冠延长术部位的牙龈组织，取样部位牙龈无炎症、BOP（-）、PD≤3 mm；牙周炎患者取自因牙周炎需要拔除患牙的部位。取样位点排除标准：1）龋齿；2）牙周脓肿；3）牙周—牙髓联合病变；4）有邻面充填体、嵌体或冠修复。

在牙龈组织获取牙位的颊侧近中位点采集GCF，并记录临床指标（PLI、BI、PD、CAL），取样方法同前。GCF样品使用Whatman^®3MM色谱滤纸采集，所有滤纸用无菌组织剪修剪成每条2 mm×10 mm大小，称重并计量，备用。棉卷隔湿目标牙，三用喷枪吹干牙面，将一条滤纸条缓慢插入牙周袋或龈沟内1~2 mm，静置30 s取出^[16]。将4个象限取出的滤纸条转移至同一1.5 mL离心管中。血液或唾液污染样本不被纳入。离心管中加入0.01 mol/L PBS 300 μL（pH值7.4）室温摇床洗脱1 h，4 ℃离心5 500 r/min 20 min，提取200 μL上清液，-80 ℃保存。GCF用于提取和检测cfDNA。GCF采集后，局麻下切除2 mm²牙龈组织，使用生理盐水对牙龈样本进行冲洗，去除血污后置于4%多聚甲醛中固定或液氮冻存，备用。

1.4 GCF cfDNA的提取与定量检测

采用血清/血浆游离DNA提取试剂盒和Quant-iT^TM PicoGreen^TM dsDNA定量试剂盒进行cfDNA的提取和定量。cfDNA定量检测方法如下。使用TE缓冲液稀释样本，按照说明书设定标准曲线，将50 μL PicoGreen和50 μL cfDNA洗脱液添加至黑色不透明96微孔板中，室温避光孵育2~5 min。使用酶标仪测量荧光强度（激发波长490 nm，发射波长520 nm），计算cfDNA浓度。GCF cfDNA浓度数据以mg/mL per 30-s sample为单位报告^[16]。

1.5 GCF cfDNA体外刺激HGFs

为进一步评估cfDNA对免疫反应的影响，分别从健康组或牙周炎组的混合GCF中提取cfDNA，参考Lipofectamine^TM3000试剂盒说明书，将第3~6代对数生长期的HGFs制备成单细胞悬液，按照密度为5×10⁵个/mL接种6孔板中，待细胞铺满瓶底70%~90%，健康组、牙周炎患者GCF来源cfDNA（200 ng/mL）^[17]刺激HGFs 48 h，设置空白对照组。采用Trizol试剂提取细胞总RNA，备用。

1.6 免疫荧光染色

牙龈组织石蜡切片常规脱蜡水化，PBS洗3次，每次5 min；改进型柠檬酸钠抗原修复液（×50）微波炉修复20 min，PBS洗3次，每次5 min；阻断内源性过氧化物酶37 ℃下孵育25 min，PBS洗3次，每次5 min；使用新鲜配制的5%山羊血清37 ℃下孵育30 min，倾去，不洗；加一抗cGAS（1∶100）、STING（1∶100）、p-STING（1∶100）、牙龈上皮细胞标志物CK14（1∶100）、HGFs标志物FSP-1（1∶100），4 ℃湿盒中孵育过夜。次日取出湿盒复温，PBS洗3次，每次5 min；在避光条件下同时滴加荧光二抗AF488（1∶200）和荧光二抗AF594（1∶200），37 ℃下孵育50 min，PBS洗3次，每次5 min；加入DAPI（细胞核染色）室温下孵育10 min，PBS洗3次，每次5 min；抗荧光衰减封片液封片，4 ℃避光保存。荧光显微镜下观察切片，使用Image J/Fiji软件对图片进行分析，GraphPad Prism 9.0软件进行统计分析并绘图。

1.7 Western blot 法

检测HGFs的cGAS、STING、p-STING蛋白表达，刺激方法同1.5。全程冰上操作，使用PBS清洗细胞后加入RIPA裂解液，待细胞充分裂解后收集细胞，4 ℃ 12 000 r/min离心15 min，收集上清液，BCA法测定蛋白浓度，100 ℃加热10 min使蛋白变性，-80 ℃保存备用。SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，无蛋白快速封闭液封闭10 min，加入一抗（GAPDH 1∶10 000，cGAS 1∶2 000，STING 1∶2 000，p-STING 1∶2 000）4 ℃过夜，洗膜后进行二抗孵育1 h，曝光显影。

1.8 定量逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）

液氮碾碎-80 ℃ 冷冻保存的牙龈组织，Trizol试剂提取组织/HGFs总RNA，紫外分光光度仪检测样品RNA浓度（A₂₆₀/A₂₈₀>1.8），配比20 μL反转录体系（1 000 ng RNA，4 μL反转录预混液、dd-H₂O配平），反转录cDNA。所用cGAS、STING、核转录因子κB抑制蛋白激酶（inhibitor of kappa B kinase，IKK）、NF-κB p65、IL-6、TNF-α、IL-1β引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司设计并合成（表1）。采用设计好的正反向特异性引物进行聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增，95 ℃预变性2 min；变性95 ℃ 15 s，延伸1 min，共40个循环。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogena-se，GAPDH）为内参，检测各组mRNA相对表达量。用2^-△△Ct法计算牙龈组织、HGFs中目的基因的mRNA表达量。

1.9 统计学分析

每个实验重复3次。采用GraphPad Prism 9.0软件对结果数据进行统计学分析并绘制统计图。GCF cfDNA浓度与各牙周临床指标或cGAS-STING信号通路核心分子的相关性分析采用斯皮尔曼相关性分析。组间比较采用t检验，多组组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 GCF cfDNA浓度与牙周临床指标的相关性分析

受试者一般资料见表2。其中，健康组年龄（24.00±1.48）岁，BMI（21.06±1.72）kg/m²；牙周炎组年龄（30.20±3.87）岁，BMI（21.53±2.19）kg/m²，2组年龄间差异有统计学意义（P<0.001），但BMI值间差异无统计学意义。牙周炎组GCF cfDNA浓度［（13.45±2.06）mg/mL］高于健康组［（1.76±1.09）mg/mL］（P<0.000 1）。

GCF cfDNA浓度与牙周临床指标的相关性分析见表3。相关性分析表明：GCF cfDNA浓度与研究对象的年龄、全口PLI、取样位点PLI、全口BI、取样位点BI、全口PD、取样位点PD、全口CAL、取样位点CAL呈强正相关性（P<0.01）。以上结果提示：GCF cfDNA浓度与牙周临床指标具有关联性，GCF cfDNA浓度可能随牙周临床指标的恶化而升高。

2.2 牙龈组织中cGAS、STING、p-STING的免疫荧光染色结果

与健康组相比，牙周炎组牙龈组织中cGAS⁺、STING⁺、p-STING⁺的绿色荧光信号增强（图1）。牙周炎组cGAS⁺/FSP-1⁺、STING⁺/FSP-1⁺、p-STING⁺/FSP-1⁺荧光共定位面积占FSP-1⁺的百分比高于健康组（P<0.05）；而牙周炎组cGAS⁺/CK14⁺、STING⁺/CK14⁺、p-STING⁺/CK14⁺荧光共定位面积占CK-14⁺的百分比与健康组相比，差异无统计学意义（P>0.05）。提示：牙周炎组牙龈组织中cGAS⁺、STING⁺、p-STING⁺增强的绿色荧光信号主要由HGFs表达。

2.3 牙龈组织中cGAS-STING通路关键分子的mRNA表达结果

与健康组相比，牙周炎组牙龈组织中cGAS、STING、IKK、NF-κB p65的mRNA表达升高，差异具有统计学意义（P<0.05）。其下游炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表达量在牙周炎组也较健康组升高，差异具有统计学意义（P<0.05）（表4）。

2.4 牙龈组织取样位点GCF cfDNA浓度与cGAS-STING信号通路核心分子的相关性分析

牙龈组织取样位点GCF cfDNA浓度分析结果显示：牙周炎组牙龈组织取样位点的GCF cfDNA浓度（15.90±6.32）mg/mL高于健康组（1.17±0.80）mg/mL（P<0.000 1）。将牙龈组织取样位点GCF cfDNA浓度与cGAS-STING信号通路核心分子（cGAS、STING、IKK、NF-κB p65、IL-1β、IL-6、TNF-α）的mRNA表达水平进行相关性分析，结果显示：cfDNA浓度与cGAS（r=0.72，P<0.05）、STING（r=0.83，P<0.001）、NF-κB p65（r=0.79，P<0.001）、IL-6（r=0.75，P<0.05）的mRNA表达呈正相关性（图2）。

2.5 GCF cfDNA对HGFs表达cGAS-STING信号通路核心分子的影响

与对照组相比，健康组、牙周炎组GCF来源cfDNA刺激HGFs细胞48 h，cGAS和p-STING的蛋白表达水平升高，STING的蛋白水平无明显变化（图3A），同时可显著上调cGAS、STING、IKK、NF-κB p65及促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表达（P<0.05），其中牙周炎组IKK、TNF-α的mRNA表达高于健康组（P<0.05）（图3B~H）。

3 讨论

先天免疫系统是宿主抵抗病原微生物的第一道防线，需要模式识别受体与分子模式的相互识别来启动^[18]。既往研究^[4,19-21]表明：体液中微生物及宿主细胞来源的cfDNA可识别多种核酸感受器（如cGAS、AIM2、TLR9）激活先天免疫，从而在机体抵抗微生物、自身免疫性疾病、肿瘤免疫等多种生理及病理过程中发挥作用。有研究^[22]发现：类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）患者的滑膜液及血清样本中cfDNA水平与关节炎症反应、RA疾病活动性之间存在强正相关性。随后通过建立胶原诱导的关节炎（collagen-induced arthritis，CIA）小鼠模型发现：CIA小鼠滑膜液中的cfDNA水平和促炎细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF）水平均较健康小鼠高；与未经处理的CIA小鼠相比，经bDNA模拟物低甲基化胞嘧啶磷酸鸟苷刺激的小鼠关节表面骨吸收更多，骨密度更低；而使用cfDNA清除剂可显著抑制关节炎症，并有效保护关节软骨和骨。课题组前期研究^[8,23]也证实：牙周炎微环境中的cfDNA具有促进牙槽骨炎症性骨吸收的作用，使用cfDNA清除剂G3^@SeHANs可显著抑制牙周炎症和牙槽骨破坏。研究^[24]表明，随着年龄增长，机体的慢性炎症反应加剧，会导致cfDNA水平升高。本研究结果发现：牙周炎组的年龄显著高于健康组，且年龄与cfDNA浓度呈正相关性，这可能是2组cfDNA水平差异的一个因素。另有研究^[25]表明，BMI较高的人群的慢性炎症会增加细胞凋亡和坏死，从而释放更多的cfDNA。本研究结果发现：健康组及牙周炎组的BMI差异无统计学意义，说明2组纳入者的健康营养状况基本相同。牙周炎患者GCF中的cfDNA浓度显著高于对照组，且与全口平均PLI、BI、PD、CAL和取样位点平均PLI、BI、PD、CAL之间均呈强正相关性。牙周炎龈下微环境中bDNA显著升高，且炎症导致宿主细胞死亡，造成胞质DNA、mtDNA、NETs等释放，牙周局部微环境中的cf-DNA随着疾病的进程异常积累^[5-7]，可能放大先天免疫反应，与牙周炎的发病机制密切相关。有学者^[26]发现慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）患者的中性粒细胞在香烟烟雾刺激下具有更强的释放NETs的能力，且含有更高比例的mtDNA和高水平的氧化损伤DNA（NETs-DNA），NETs-DNA促进了人气道上皮细胞增殖、NF-κB相关细胞因子和IFNs的表达及分泌，并促进人树突状细胞成熟。这些效应在沉默或抑制DNA传感器cGAS或TLR9后缓解或逆转。随后使用cGAS^-/-、TLR9^-/-基因敲除小鼠在体内阻断NETs-DNA的感应、使用mitoTEMPO抑制NETs生成、使用DNaseⅠ降解NETs，均可降低经香烟烟雾诱导的COPD小鼠模型中NETs的浸润、NF-κB相关炎症因子的表达，缓解其气道炎症、气流受限和肺气肿程度。综上，cfDNA可能是牙周炎免疫炎症反应的重要刺激物，cfDNA及其相关信号通路可作为拮抗靶点，用于开发疾病治疗的新手段。

cGAS是一种细胞质DNA感受器，可识别来自病原体等外来入侵者及宿主自身DNA，催化合成其第二信使2’3’-环鸟苷酸-腺苷酸（cyclic GMP-AMP dinucleotide，2’3’-cGAMP），后者可以直接激活内质网膜上的STING，使其发生构象变化。活化的STING可以诱发多样化的下游通路，包括TBK1-IRF3信号轴活化、激活NF-κB、诱导自噬及细胞死亡等，在免疫炎症反应中扮演重要角色^[27]。Ma等^[28]研究发现，卡波西肉瘤相关疱疹病毒中的病毒干扰素调节因子1可以直接结合cGAS，阻止STING与TBK1相互作用，从而抑制STING磷酸化和伴随的IFN-β产生，继而抑制DNA感应途径。STING在动脉粥样硬化中也发挥重要作用。有学者^[29]发现与野生型小鼠相比，西方饮食喂养的载脂蛋白E缺陷（ApoE^-/-）小鼠中STING表达和DNA损伤标志物，如γ-H2AX、p53和单链DNA均显著增加；与对照组相比，ApoE^-/-小鼠中STING缺失减少了主动脉弓的动脉粥样硬化病变程度、斑块中脂质和巨噬细胞的积聚、主动脉炎症分子的表达，使用特异性抑制剂C-176阻断STING可改善ApoE^-/-小鼠动脉粥样硬化的形成。目前cGAS-STING信号通路在牙周炎炎症调节机制中的作用仍未被充分探究。免疫组化法检测牙龈组织中STING的结果显示：与健康者相比，牙周炎患者牙龈结缔组织层存在强烈的STING积累^[30]，然而样本量过少（每组1例），且未对cGAS进行分析。最近研究^[26]表明：使用牙龈卟啉单胞菌处理HGFs细胞后，cGAS、STING的蛋白相对表达量显著升高，且IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-β的mRNA表达显著升高，此外与野生型小鼠相比，使用STING抑制剂的牙周炎小鼠的炎症细胞因子和破骨细胞形成显著降低。有学者^[31]将牙龈卟啉单胞菌外膜囊泡（Porphyromonas gingivalis outer membrane vesicles，Pg-OMVs）与血管内皮细胞（endothelial cells，ECs）共培养后发现，Pg-OMVs通过激活cGAS-STING-TBK1通路抑制ECs的迁移和成骨分化。另有学者^[5,32]发现脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可以通过激活cGAS-STING信号通路从而诱导M1巨噬细胞发生极化，而胰岛素样生长因子2（insulin-like growth factor-2，IGF2）可以下调cGAS、STING、p65的磷酸化，从而抑制M1巨噬细胞极化，促进小鼠牙周炎模型的成骨。本研究发现GCF cfDNA水平在牙周健康者和牙周炎患者中存在差异，升高的cfDNA是否可触发牙周组织HGFs cGAS-STING信号通路，引起细胞炎症反应并进一步破坏牙周稳态，该问题值得深入研究。本研究结果显示：牙周炎组牙龈组织取样位点的cfDNA浓度显著高于对照组，同时，牙周炎组牙龈组织中cGAS、STING及其下游IKK、NF-κB p65、IL-1β、IL-6、TNF-α的基因表达水平显著升高，且免疫荧光结果显示牙周炎组牙龈组织cGAS、STING、p-STING与HGFs标志物FSP-1的荧光共定位面积百分比显著高于健康组，提示：牙周炎症状态下GCF cfDNA异常积累，并可能通过激活HGFs中的cGAS-STING信号通路进一步促进牙周组织炎症反应。

HGFs是牙龈结缔组织中的主体细胞，在牙周组织修复中起着重要作用^[31]。近年的单细胞测序研究^[33]提示：HGFs通过表达多种趋化因子配体和模式识别受体，与免疫细胞之间发生大量的交互影响，与进行性、破坏性牙周免疫反应有关，在牙周免疫稳态的调控中扮演重要作用。为研究GCF中升高的cfDNA是否激活HGFs的cGAS-STING信号通路，本实验将健康组和牙周炎组来源的cfDNA经lipo3000刺激至HGFs，结果显示：与对照组相比，健康组或牙周炎组GCF来源cfDNA刺激HGFs细胞后，细胞cGAS、p-STING的蛋白表达呈上升趋势。且健康组或牙周炎组GCF来源的cfDNA刺激HGFs细胞可显著上调cGAS、STING、IKK、NF-κB p65及促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表达，其中IKK、TNF-α的mRNA表达在牙周炎组高于健康组。提示：GCF中cfDNA可能通过激活cGAS-STING信号通路，诱导HGFs细胞放大牙周组织局部炎症反应。GCF cfDNA在牙周微环境中调控免疫炎症反应的具体机制值得未来进一步探索。

综上所述，本研究表明牙周炎患者GCF中的cfDNA水平与牙周临床指标呈强正相关，牙周炎患者牙龈组织中cGAS-STING信号通路相关分子表达上调，GCF cfDNA通过激活cGAS-STING信号通路诱导HGFs细胞发生炎症反应。然而cfDNA激活的cGAS-STING信号通路在牙周疾病过程中的具体作用机制仍需要通过体外和体内实验进一步研究，这将为牙周病的防治提供新的思路和策略。

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基金资助

国家自然科学基金(81970944)

国家自然科学基金(81991501)

国家自然科学基金(81991502)

四川省自然科学基金(2023NSFSC0553)