墨旱莲—女贞子治疗牙周炎的潜在成分及作用机制

Mechanism of Eclipta prostrata L-Ligustrum lucidum Ait in the treatment of periodontitis

摘要

目的 使用网络药理学与分子对接技术，探讨墨旱莲-女贞子（EPL-LLA）治疗牙周炎的潜在靶点和分子机制，并通过体外实验探究其生物相容性、对炎症相关因子的调控及抗氧化作用。 方法 通过多种数据库筛选并预测EPL-LLA的活性成分和潜在靶点，将其与牙周炎相关靶点取交集，通过STRING数据库构建蛋白质相互作用网络（PPI）。利用Metascape数据库进行基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。将节度点值前6的药物活性成分与通过PPI筛选出的核心靶点进行分子对接，并将结合能较好的结果进行可视化分析。建立体外细胞模型，通过细胞计数试剂盒（CCK-8）、实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）荧光探针，探究EPL-LLA的生物相容性、对炎症因子的调控作用及抗氧化作用。 结果 经筛选，EPL含有13种活性成分，对应220个潜在靶点；LLA含有10种活性成分，对应283个潜在靶点；牙周炎相关靶点1 643个；三者共有91个交集靶点。交集靶点经GO和KEGG富集分析，共筛选出5 271个条目和253条信号通路。分子对接结果证实节度点值前6的药物活性成分与核心靶点能够较好地结合。CCK-8实验显示浓度在0.02 mg/mL内的EPL-LLA具有良好的生物相容性（P<0.05）；qRT-PCR显示EPL-LLA降低牙龈卟啉单胞菌脂多糖刺激后巨噬细胞促炎因子mRNA的表达，同时上调抑炎因子mRNA的表达（P<0.05）；利用DCFH-DA荧光探针检测证实EPL-LLA具有清除活性氧（ROS）的能力（P<0.05）。 结论 EPL-LLA可通过多成分、多靶点、多通路治疗牙周炎，为进一步研究其对牙周炎的治疗提供了理论依据。

Abstract

Objective This study aimed to explore the potential target and molecular mechanism of Eclipta prostrata L-Ligustrum Lucidum Ait (EPL-LLA) in the treatment of periodontitis by using network pharmacology and molecular docking technology, and to explore its biocompatibility, regulatory effects on inflammatory factors, and antioxidant acti-vity through in vitro experiments. Methods The active components and potential targets of EPL-LLA were screened and predicted through a variety of databases, and the intersection of EPL-LLA and periodontitis targets was selected. The protein interaction network (PPI) was analyzed by the string platform. The Metascape database was used for gene ontology (GO) and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway enrichment analysis. The active ingredients from the top 6 degrees were docked with the core targets, and the results of binding energy were visualized. An in vitro cell model was established to evaluate the biocompatibility, modulation of inflammatory factors, and antioxidative effects of EPL-LLA through cell counting kit-8 (CCK-8), quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) and 2’,7’-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) fluorescent probe assays. Results Screening revealed 13 active components in EPL corresponding to 220 potential targets, 10 active components in LLA corresponding to 283 potential targets, and 1 643 periodontitis-related targets, with 91 shared targets among the three. GO analysis of the shared targets yielded 5 271 entries, while KEGG enrichment analysis indicated involvement in 253 signaling pathways. Molecular docking confirmed stable binding between the top 6 active components and core targets. CCK-8 assays demonstrated good biocompatibility of EPL-LLA at concentrations 0.02 mg/mL (P<0.05). qRT-PCR showed that EPL-LLA reduced the mRNA expression of pro-inflammatory factors in macrophages stimulated by Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide while upregulating anti-inflammatory factor mRNA expression (P<0.05). DCFH-DA fluorescence probe assays confirmed the reactive oxygen species (ROS)-scavenging capacity of EPL-LLA (P<0.05). Conclusion EPL-LLA may treat periodontitis through multi-component, multi-target, and multi-pathway mechanisms, providing a theoretical basis for further research on its therapeutic potential.

Graphical abstract

关键词

牙周炎 / 墨旱莲 / 女贞子 / 网络药理学 / 分子对接 / 巨噬细胞 / 炎症因子 / 氧化应激

Key words

periodontitis / Eclipta prostrata L / Ligustrum lucidum Ait / network pharmacology / molecular docking / macrophage / inflammatory factors / oxidative stress

牙周炎是导致成年人牙齿脱落的主要病因，并与心血管疾病^[1]、2型糖尿病等^[2]多种系统性疾病存在关联，严重影响患者的生活质量。菌斑是牙周炎的始动因子，通过洁治、刮治等物理手段清除菌斑是目前临床上治疗牙周炎的主要方法。然而，牙周炎的发病机制复杂，致病因素多样，仅依靠单纯的物理治疗手段，对牙周组织免疫炎症反应的调控尚不理想。全身或局部辅以抗生素等药物治疗，虽在一定程度上能够提升治疗效果^[3]，但存在药物滥用和产生耐药性的问题^[4]，因此，需要寻找和开发安全、经济、有效的药物。随着我国传统医学研究的进展，中草药因其多组分、多靶点、多作用途径及来源广泛、不易产生耐药性等特点，在牙周炎治疗领域正逐渐受到广泛的关注^[5]。

药对是指将两味药成对相配，是中医用药的重要形式，具有提高疗效、降低毒性和减少不良反应等优点。墨旱莲—女贞子（Eclipta prostrata L-Ligustrum lucidum Ait，EPL-LLA）是临床上常用的经典药对（配伍比例为1∶1）^[6]，其应用历史可追溯至明代。吴旻辑在《扶寿精方》中详细记载了该药对的组方原理与临床应用，强调其滋阴补肾、清热凉血的功效，尤其适用于肝肾阴虚所致诸症。在中医理论中，牙周炎归属于“牙宣”范畴，其发病常与肝肾阴虚、虚火上炎相关^[7]，因此EPL-LLA可从整体上改善机体状态，从而缓解牙周炎症。此外，巨噬细胞释放的促炎因子^[8]和氧化应激^[9]在牙周炎的发生和发展中同样起着重要作用，因此降低炎症因子、减轻氧化应激对牙周炎的治疗具有重要意义。有研究表明EPL-LLA能够抑制白细胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α等炎症细胞因子释放^[10-11]，同时富含黄酮类、酚类等成分，具有显著的抗氧化作用^[12-13]。综上所述，EPL-LLA在治疗牙周炎方面展现出了一定的潜力，有望被开发为一种新型的牙周炎辅助治疗药物。目前尚未有关于EPL-LLA治疗牙周炎的具体活性成分及其核心作用靶点的详细报道。

网络药理学是一种整合计算机科学与医学的多学科研究方法，在中药研究中应用广泛。该方法从整体角度分析药物作用机理，考虑药物的多成分、多靶点、多通路及多途径特性，系统阐释药物与疾病间的相互作用关系，为理解药物作用机制提供了新视角和工具^[14]。本研究采用网络药理学结合体外实验的方法，旨在探索EPL-LLA治疗牙周炎的潜在活性成分及作用机制，以期为该药对的后续实验研究及临床应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 网络药理学

1.1.1 检索药物活性成分及靶点

在TCMSP数据库（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）中，依据吸收、分布、代谢和排泄标准参数——口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、类药性（drug-likeness，DL）≥0.18%^[15]，分别筛选出EPL和LLA的活性成分。随后，通过利用Swiss Target Prediction数据库^[16]预测这些成分的潜在作用靶点，并通过Cytoscape 3.10.2软件构建药物—活性成分—靶点网络关系图。

1.1.2 筛选牙周炎相关靶点

以“periodontitis”为关键词，分别在GeneCards数据库（www.genecards.org）^[17]、DrugBank数据库（https://go.drugbank.com）、TTD数据库^[18]和OMIM数据库（www.omim.org）中检索牙周炎的潜在靶点，将检索的靶点进行去重后得到牙周炎的相关靶点。

1.1.3 构建牙周炎—药物活性成分靶点交集及药物—活性成分—靶点—牙周炎网络关系图

将牙周炎相关靶点和EPL-LLA活性成分预测的靶点通过线上分析工具JVENN（http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html）取交集形成韦恩图，该交集靶点即为EPL-LLA活性成分治疗牙周炎的潜在作用靶点。将EPL-LLA的活性成分及与牙周炎交集靶点导入Cytoscape 3.10.2软件中，构建药物—活性成分—靶点—牙周炎网络关系图。

1.1.4 构建蛋白质相互作用网络（protein-protein interaction network，PPI）关系图及筛选核心靶点

在STRING数据库（https://string-db.org）^[19]导入交集靶点，以蛋白间最低相互作用得分>0.4为信度依据，隐藏网络联结外的节点，形成PPI关系图。利用Cytoscape 3.10.2软件中的CytoHubba插件分析筛选核心靶点，并形成核心靶点图。

1.1.5 基因本体论（gene ontology，GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

将交集靶点导入Metascape数据库（https://www.metascape.org/gp/index.html）中，进行GO和KEGG富集分析，以-log（P）值为依据，利用微生信平台（http://www.bioinformatics.com.cn）将GO分析结果排在前10的内容绘制柱状图，KEGG分析排名前20的信号通路绘制为气泡图。

1.2 分子对接分析

选择药物—活性成分—靶点—牙周炎中的节度点（degree）值排名前6的药物活性成分与通过PPI网络筛选的10个核心靶点进行分子对接。通过PubChem数据库（http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获得活性成分的3D结构，接着通过PDB数据库（https://www.rcsb.org）获得核心靶点的结构及身份标识号（表1）。通过分子图形软件PyMOL 3.0.3去除水分子和小分子配体后，利用Auto Dock Vina 1.1.2软件添加极性氢和科尔曼电荷进行进一步预处理，构建对接口袋，在受体蛋白上设置中心及参数，以保证蛋白完全被覆盖。分子对接后生成活性位点位置，并计算结合能和氢键数，使用PyMOL 3.0.3软件将结合能较好的分子对接结果进行可视化分析。

1.3 体外实验

1.3.1 制备EPL-LLA水煎液

取EPL和LLA饮片（长春安国中药饮片有限公司），按1∶1精确称量，加入10倍量的超纯水，浸泡1 h后，再煎煮1 h，提取2次，合并滤液，经浓缩调整至生药含量达200 mg/mL，无菌分装、妥善封存备用^[20]。

1.3.2 主要试剂与仪器

杜氏改良Eagle培养基（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）（北京中生奥邦生物科技有限公司），胎牛血清（武汉普诺赛生命科技有限公司），磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）（北京兰杰柯科技有限公司），细胞计数试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）（北京酷来搏科技有限公司），牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，P. gingivalis）脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）、总RNA提取试剂（Sigma公司，美国），逆转录试剂盒、实时聚合酶链反应试剂盒（上海翊圣生物科技有限公司），2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯（2’,7’-Dichlorodihydrofluorescein dia-cetate，DCFH-DA）（北京索莱宝科技有限公司）。

低温高速离心机（OHAUS公司，美国）、实时荧光定量聚合酶链反应仪（Roche公司，瑞士）、恒温培养箱（SANYO公司，日本）、酶标仪（Agilent公司，美国）、荧光倒置显微镜（OLYMPUS公司，日本）。

1.3.3 CCK-8法检测细胞活力

实验分组如下。1）空白组：无细胞，仅含CCK-8液与DMEM完全培养基；2）对照组：DMEM完全培养基处理细胞；3）将EPL-LLA按不同浓度分为5组，分别为0.1、0.2、0.39、0.78、1.56 mg/mL。以3×10³/孔的密度在96孔板中接种RAW264.7细胞，孵育24 h，弃去旧培养基，按实验分组加入不同浓度的EPL-LLA，分别在培养24 h和48 h后弃旧培养基，加入含有10%CCK8溶液的新培养基，进一步孵育2 h。用酶标仪测量450 nm处的吸光度（optical density，OD）值，计算细胞相对活力（%）=（EPL-LLA组OD值-空白组OD值）/（对照组OD值-空白孔OD值）×100%，筛选出3个浓度的EPL-LLA，进行后续实时定量聚合酶链反应和抗氧化实验。

1.3.4 实时定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）检测炎症因子的表达

实验分组如下。1）对照组：用DMEM完全培养基处理细胞；2）LPS组：1 μg/mL P. gingi-valis LPS处理细胞；3）0.05mg/mL EPL-LLA组：1 μg/mL P. gingivalis LPS+0.05 mg/mL EPL-LLA处理细胞；4）0.1 mg/mL EPL-LLA组：1 μg/mL P. gingivalis LPS+0.1 mg/mL EPL-LLA处理细胞；5）0.2 mg/mL EPL-LLA组：1 μg/mL P. gingivalis LPS+0.2 mg/mL EPL-LLA处理细胞。以2×10⁵/孔的密度在6孔板中接种RAW264.7细胞，孵育24 h使其贴壁。按实验分组用相应浓度的EPL-LLA进行18 h预处理，然后加入1 μg/mL P. gingivalis LPS处理6 h。

提取每组细胞总RNA后通过逆转录合成cDNA，按实时聚合酶链反应试剂盒说明书进行后续实验，以β-肌动蛋白（beta actin，β-actin）作为内参基因进行校正分析，采用2^-ΔΔCt比较法测定促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6及抑炎因子IL-10 mRNA的表达水平。引物序列如表2所示。

1.3.5 DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）

分组同1.3.4，以5×10⁴/孔的密度在12孔板中接种RAW264.7细胞，孵育24 h使其贴壁。按实验分组用相应浓度的EPL-LLA进行24 h预处理，然后加入1 μg/mL P. gingivalis LPS处理12 h。吸弃旧培养基，每孔加入500 μL无血清培养基稀释（1∶1 000）的DCFH-DA探针，黑暗条件下继续孵育30 min后，使用无血清培养基清洗3次，以保证未进入细胞内的探针被彻底清除。倒置荧光显微镜下观察荧光强度并拍照保存，同时获取明场图像以展示细胞形态。使用ImageJ软件对荧光信号进行分析。

1.3.6 统计分析

采用GraphPad Prism 9.0软件对实验数据进行数据分析及绘图，上述体外实验的结果重复3次，所有结果均用均数±标准差（\overline{x}±s）表示，组间比较符合正态分布和方差齐性检验则采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 网络药理学

2.1.1 检索药物活性成分及靶点

以OB≥30%和DL≥0.18%为标准，从TCMSP数据库中筛选出EPL活性成分10个，LLA的活性成分13个，其中木犀草素和槲皮素为两者共有的活性成分（表3）。利用Swiss Target Prediction数据库预测上述活性成分的潜在作用靶点，经合并及去重后，分别得到EPL活性成分潜在作用靶点220个和LLA活性成分潜在作用靶点283个。通过Cytoscape软件构建了药物—活性成分—靶点网络关系图（图1）。

2.1.2 筛选牙周炎相关靶点

以Relevance score值≥1为标准，从GeneCards数据库筛选得到1 612个牙周炎相关基因靶点；DrugBank数据库提供了42个相关基因；TTD和OMIM数据库分别检索出1个和8个相关靶基因。通过对这4个数据库检索结果的整合和去重，最终确定了1 643个牙周炎相关靶点。

2.1.3 构建牙周炎—药物活性成分靶点交集及药物—活性成分—靶点—牙周炎网络关系图

利用线上在线分析工具JVENN对EPL和LLA活性成分的潜在作用靶点与牙周炎相关靶点取交集后共获得91个交集靶点（图2A）。同时基于Cytoscape 3.10.2软件构建出EPL-LLA治疗牙周炎的药物—活性成分—靶点—牙周炎网络关系图，见图2B。

2.1.4 构建PPI网络关系图及筛选核心靶点

将91个交集靶点导入STRING数据库形成PPI关系图（图3），在Cytoscape 3.10.2软件形成交集靶点的可视化图形（图4），并利用CytoHubba插件分析进一步确定了TP53、AKT1、STAT3、BC-L2、HIF-1A、MMP9、ESR1、EGFR、NFκB1、TNF共10个核心靶点（图5），按其程度算法得分排序，用颜色表示节点程度。

2.1.5 GO分析和KEGG通路富集分析

GO分析结果显示EPL-LLA改善牙周炎的生物过程（biological process，BP）共4 238个，主要包括激素反应、细胞迁移、运动正向调节及运动能力的正向调节等；细胞组分（cellular component，CC）共涉及348个，交集靶点主要定位于受体复合物、膜筏、膜微区、黏着斑等；根据分析显示分子功能（molecular function，MF）涉及685个，涉及蛋白激酶活性、磷酸转移酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性等。以-log（P）值为依据，将GO功能富集分析结果排在前十的内容，绘制柱状图（图6）。

KEGG分析结果显示交集靶点共涉及253条通路，主要包括：癌症相关信号通路、磷脂酰肌醇3—激酶—蛋白激酶B（phos-phatidylinositol 3-kinase-protein kinase B，PI3K-Akt）信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路等。将排名前二十的信号通路绘制为气泡图（图7）。

2.2 分子对接结果及示意图

分子对接结合能越低表示受体与配体亲和力越好，本研究结果显示6种重要活性成分与10个靶点结合能均低于-5.0 kcal/mol，有较好的结合活性^[21]，其中各活性成分与靶点MMP9的结合最为密切（表4）。主要活性成分与10个核心靶点均能较好的结合，将每一种活性成分与其中一个靶点的对接可视化进行可视化展示（图8），进一步证实了EPL-LLA多成分、多靶点的作用。

2.3 体外实验

2.3.1 CCK-8实验结果

如图9所示，当EPL-LLA浓度高于0.39 mg/mL时，RAW264.7细胞的存活率开始下降，结合24 h与48 h实验结果，选择浓度为0.2、0.1、0.05 mg/mL的EPL-LLA，进行后续实验。

2.3.2 炎症因子mRNA的表达

如图10所示，与对照组相比，LPS组促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α的mRNA表达显著增加（P<0.05），证明了炎症模型的成功构建，抗炎因子IL-10 mRNA表达增加可能与激活细胞本身抗炎反应相关，但差异不具有统计学意义（P>0.05）；与LPS组相比，经不同浓度EPL-LLA处理后，促炎因子表达水平明显降低而抗炎因子表达显著升高（P<0.05）；除TNF-α以外，其余炎症因子未表现出明显的药物浓度依赖性。实验结果表明EPL-LLA抑制P. gingivalis LPS诱导巨噬细胞促炎因子表达的同时可上调抗炎因子的表达，说明该药对可能通过抑制炎症反应和增强保护性反应，发挥抗炎和细胞保护作用。

2.3.3 EPL-LLA体外抗氧化性

DCFH-DA荧光探针检测结果如图11所示：与对照组相比，LPS组的荧光强度显著增加（P<0.05），表示LPS刺激可显著增加细胞内ROS的水平，而经不同浓度的EPL-LLA处理后，均可观察到荧光强度的降低，差异有统计学意义（P<0.05），这表明不同浓度的EPL-LLA均可降低细胞内ROS的水平。

3 讨论

牙周炎是由菌斑微生物引发的牙周组织慢性炎症，是全球最普遍的口腔疾病之一，并与全身系统性疾病密切相关，给患者造成沉重的医疗负担^[22]。牙周炎具有复杂的发病机制，牙周致病菌释放的LPS能激活巨噬细胞表面Toll样受体4，使其转为促炎模式并释放TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎细胞因子，破坏牙周组织稳态并加剧炎症反应^[8]，炎症因子的浓度与牙周炎的严重程度密切相关^[23]。除此之外，近年来研究表明，活性氧与机体抗氧化防御系统的动态平衡失调也是导致牙周炎发生的重要原因^[9]。

因此，抑制促炎因子释放，清除过量ROS在治疗牙周炎中具有重要意义。EPL-LLA是临床上常用的经典药对，具有抗炎、抗氧化和免疫调节等多种作用，同时作为天然药物可以避免化学药物产生的副作用。本研究通过网络药理学并结合分子对接技术和体外实验对EPL-LLA治疗牙周炎的活性成分、潜在靶点和分子机制进行了筛选和初步验证。

网络药理学分析揭示了EPL的主要活性成分为金合欢素、紫铆亭等；LLA的活性成分为圣草酚、山柰酚等；木犀草素与槲皮素是两者共同的活性成分。PPI中排名前十的TP53、AKT1、STA-T3、BCL2、HIF-1A、MMP9、ESR1、EGFR、NF-κB1、TNF为药物活性成分治疗牙周炎核心靶点。木犀草素是天然类黄酮，能调控炎症信号通路抑制炎症介质、减轻牙周组织炎症^[24]；槲皮素显示出优异的抗氧化和抗炎特性，可降低人牙龈成纤维细胞中的ROS水平^[25-26]，以上研究说明EPL、LLA所共同含有的这两种物质能够从多机制协同治疗牙周炎。核心靶点AKT1是调节炎症和细胞分化的经典信号通路PI3K-Akt的关键分子。研究发现，柚皮苷能够通过AKT1/mTOR通路显著降低牙周组织中IL-6、TNF-α等炎症因子的表达水平，从而减轻牙周炎症^[27]。

交集靶点进行KEGG富集发现癌症相关信号通路、PI3K-Akt信号通路和MAPK信号通路等是EPL-LLA治疗牙周炎的潜在机制。PI3K-Akt信号通路是与炎症相关的经典通路，与牙周炎关系密切。研究发现，车前子甙通过抑制PI3K-Akt通路减轻LPS诱导的人牙龈成纤维细胞炎症反应^[28]，而骨形态发生蛋白-2则通过激活该通路促进成骨细胞分化^[29]，为牙周组织再生提供潜在治疗策略。此外，小檗碱热敏水凝胶通过调控PI3K-Akt通路^[30]，同时发挥抗炎和成骨双重作用，进一步凸显了该通路在牙周炎治疗中的重要性。

分子对接是预测配体化合物与已知三维结构蛋白连接性的技术^[31]，结合能<-5.0 kcal/mol表示配体分子与受体蛋白之间具有良好的结合活性^[21]。EPL和LLA的共有活性成分木犀草素与NFκB1的结合能较低（-6.9 kcal/mol），表明其可能通过抑制NFκB1的活性发挥抗炎作用。类似地，槲皮素与TNF的结合能（-7.4 kcal/mol）显示其可能通过阻断TNF信号通路减轻炎症反应。核心靶点AKT1与所有活性成分均能较好的结合，为EPL-LLA通过该靶点及PI3K-Akt通路治疗牙周炎提供了结构生物学层面的支持。

体外细胞实验证实EPL-LLA有良好的生物相容，浓度在0.02 mg/mL内药效明显，能够显著降低P. gingivalis LPS刺激后巨噬细胞促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的表达，同时上调抗炎因子IL-10的表达。此外，荧光显微镜观察到EPL-LLA能够有效清除细胞内ROS，减轻氧化应激。上述结果为EPL-LLA应用于牙周炎的治疗提供了研究依据。

本研究的创新性在于将我国传统药对EPL-LLA用于牙周炎治疗，并通过结合网络药理学、分子对接和体外实验，揭示了EPL-LLA在牙周炎治疗中的作用及其发挥作用的可能机制。这种多层次的研究策略不仅为中药复方的作用机制研究提供了新的思路，也为牙周炎的治疗提供了潜在的药物开发方向。尽管本研究取得了一定成果，但仍存在一些局限性：首先网络药理学和分子对接的预测结果需要进一步的体内外实验验证；其次体外实验仅针对巨噬细胞，未涉及其他牙周炎相关细胞（如成纤维细胞、上皮细胞）。未来研究可重点关注以下方向：1）开展动物实验，验证EPL-LLA在体内牙周炎模型中的治疗效果；2）分离和鉴定EPL-LLA的活性成分，研究其单独或联合作用机制；3）探索其抗氧化性，并设计体内外实验验证。4）探索其在其他炎症性疾病中的潜在应用。

综上所述，本研究通过多层次的研究策略，揭示了EPL-LLA在牙周炎治疗中的作用机制。研究表明，EPL-LLA可能通过多成分（如木犀草素、槲皮素、金合欢素等）、多靶点（如NFκB1、TNF、AKT1等）、多通路（如PI3K-Akt、MAPK等）的协同作用，调控炎症反应、清除细胞内ROS以减轻氧化应激损伤，从而发挥治疗牙周炎的作用。这些发现不仅为中医药在牙周炎治疗中的应用提供了理论依据，也为其他复杂疾病的研究提供了方法学参考。

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基金资助

吉林省科技发展计划项目(YDZJ202301ZYTS013)

吉林省教育厅科学技术研究项目(JJKH20250203KJ)