基于RAA-CRISPR/Cas12a-LFD的杜英疫病菌可视化检测技术的建立

摘要

【目的】由杜英生假隐丛赤壳菌引起的杜英疫病是杜英属植物上新发现的一种危害严重的枝干病害。目前，该病的研究仍处于起步阶段，尚缺乏有效的防控措施。本文旨在建立一种快速、可视化的杜英疫病菌检测方法，为该病害的早期监测和预警提供重要技术支持。【方法】以杜英疫病菌PsGti1基因为靶标，采用重组酶辅助扩增（RAA）反应特异性扩增靶标基因，并利用CRISPR/Cas12a体系切割靶标和荧光探针，最后利用侧向流试纸条（LFD）实现杜英疫病菌的可视化检测。【结果】（1）筛选获得针对杜英疫病菌PsGti1基因RAA扩增反应的最优引物对。（2）当Cas12a与CrRNA浓度配比分别为1μmol/L和0.125μmol/L时CRISPR/Cas12a切割反应体系的效果最好。（3）建立了基于RAA-CRISPR/Cas12aLFD的可视化检测体系，在37℃恒温反应条件下可快速检测杜英疫病菌，检测灵敏度为50 fg/μL（以gDNA为模板）和20 pg/μL（以PsGti1＿T-vector为模板）。【结论】本研究建立的杜英疫病菌RAA-CRISPR/Cas12a-LFD检测体系具有反应温度易达到、高特异性、高灵敏度和易操作等优点，适合在野外或缺乏实验室检测设备的场景下进行杜英疫病菌的检测。

关键词

杜英疫病菌 / 重组酶辅助扩增(RAA) / CRISPR/Cas12a / 侧向流试纸条(LFD) / 可视化检测

基金资助

广东省林业科技创新项目（2020KJCX004、2023KJCX022）