欧李果肉酵母cDNA文库构建及PhLDOX基因上游调控因子筛选

摘要

【目的】欧李果肉色泽鲜艳，风味独特，经济价值显著，但其果肉呈色的分子调控机制尚不明晰。本研究通过构建欧李果肉酵母cDNA文库，利用酵母单杂交技术初步筛选欧李花青素合成关键基因PhLDOX的上游调控因子，以期为揭示欧李果肉的呈色调控机制奠定前期理论基础，并为欧李后续的分子设计育种提供重要的基因资源。【方法】以不同时期红色果肉和黄色果肉欧李种质为研究材料，采用Gateway技术经过BP及LR重组反应构建酵母cDNA文库；利用RTqPCR和PlantCARE工具分析PhLDOX基因表达模式和启动子顺式作用元件，克隆该基因启动子序列并构建诱饵载体，利用酵母单杂交技术从文库中初步筛选其上游调控因子，结合不同果肉颜色种质发育时期的转录组数据进一步确定PhLDOX基因的上游调控因子。【结果】（1）文库质量鉴定结果显示：初级文库库容为1.6×10～7 CFU，文库滴度为8.0×10～6 CFU/mL；次级文库库容为1.6×10～7 CFU，文库滴度为7.8×10～6 CFU/mL，转化效率为100%，目标基因片段平均长度大于1 000 bp。（2）表达模式分析发现，PhLDOX基因在红色果肉种质中的表达水平显著高于黄色果肉种质。（3）启动子序列预测发现，PhLDOX基因启动子含有多种光响应、激素信号响应等元件及转录因子结合元件。（4）结合酵母单杂交与表达模式筛选得到PhLDOX基因上游的3个转录因子：ERF/AP2(Ph0214288)和WD40(Ph0209298、Ph0209443)。【结论】本研究成功构建了高质量的欧李果肉酵母cDNA文库，并从中筛选获得3个可能通过调控欧李花青素合成关键基因PhLDOX表达的调控因子。研究结果为进一步解析欧李不同颜色果肉呈色的分子调控机制提供了重要理论依据和关键候选基因资源，并对后续开展欧李色泽性状的分子标记辅助育种以及品质改良具有重要的应用价值。

关键词

欧李 / 果肉 / PhLDOX基因 / 花青素 / cDNA文库 / 酵母单杂交 / 转录因子 / 呈色调控机制 / 分子育种