猫疱疹病毒Ⅰ型gIgE基因缺失毒株的构建及生物学特性分析

摘要

[目的]为了开发一种能够预防感染、阻止潜伏期建立的猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)弱毒疫苗，利用同源重组以及CRISPR/Cas9技术将FHV-1的gIgE基因替换为红色荧光蛋白基因(RFP)。[方法]构建针对gIgE基因的3条sgRNA及表达Cas9蛋白的质粒，将含有sgRNA及Cas9蛋白的质粒与含有RFP的转移载体共转染到猫肾细胞(F81),通过噬斑纯化以及有限稀释方法进行病毒纯化，以重组病毒感染F81细胞连续10代验证其遗传稳定性，通过测定重组病毒以及亲本病毒H07的病毒滴度、一步生长曲线以及判断噬斑大小评价其生物学特性。[结果]成功构建了FHV-1 gIgE基因缺失毒株并将其命名为FHV-ΔgIgE-RFP;提取重组病毒DNA,通过PCR验证gIgE基因无目的条带，表明重组病毒纯化成功，再通过PCR验证RFP基因有目的条带，表明重组病毒成功插入外源基因。病毒滴度测定结果显示，与亲本病毒相比重组病毒的病毒滴度下降了90%;在F_1—F_(10)连续传代过程中RFP荧光表达且无减弱现象，表明重组病毒可稳定表达外源基因；测定FHV-ΔgIgE-RFP以及H07的生长曲线，重组病毒的生长趋势与亲本病毒大致相同，表明插入外源基因并不会改变病毒本身的生长特性；噬斑观察及染色结果显示，在病毒感染细胞前、后期，重组病毒的噬斑都小于亲本病毒，表明缺失gIgE基因后病毒毒力下降。[结论]成功构建并筛选出FHV-1 gIgE基因缺失致弱毒株，为开发疱疹病毒弱毒活载体疫苗奠定了基础。

关键词

猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1) / 致弱毒株 / 重组病毒 / 病毒筛选

基金资助

江苏省农业科技自主创新资金项目[CX(22)2016]; 南京农业大学校企合作项目(技术服务类)