VvmiR396及其靶基因VvGRF1在葡萄种子发育过程中的表达分析

摘要

[目的]本文旨在鉴定葡萄miR396家族成员(VvmiR396)及其靶基因VvGRF1,探究VvmiR396-VvGRF1在种子败育/发育中的作用模式。[方法]通过miR-RACE、RLM-RACE、PPM-RACE、烟草共转化活体验证等方法鉴定VvmiR396及其靶基因，利用生物信息学分析其潜在功能与进化保守性，利用RT-qPCR方法检测VvmiR396在有核和无核品种中的时空表达差异及VvmiR396-VvGRF1相关性差异。[结果]与葡萄品种‘魏可’相比，‘京可晶’花后28 d时种子发育被严重抑制，出现败育且种子萎缩，而‘魏可’种子正常发育。对VvmiR396a、VvmiR396b、VvmiR396c、VvmiR396d的前体及其成熟体序列进行鉴定，其前体均可形成典型的茎环结构，成熟体序列均位于茎环的5′臂上。VvmiR396与烟草、番茄等物种的同源序列亲缘关系较近，而与小麦的亲缘关系较远。预测到VvmiR396的8条潜在靶基因，利用RLM-RACE、PPM-RACE技术体外鉴定到VvGRF1和VvGRF10是VvmiR396的真实靶基因，且VvmiR396对VvGRF1的裂解位点及频度为10~(th)(19/22、5/25)/11~(th)(2/22、2/25),对VvGRF10的裂解位点及频度为9~(th)(17/21、3/20)/11~(th)(2/21、1/20);进一步利用烟草共转化体系对它们的裂解作用进行活体验证，发现VvmiR396对VvGRF1的裂解作用强于VvGRF10。同源保守性分析发现：VvGRF1与胡杨、毛白杨、荷花、烟草等物种的亲缘关系较近，且不同物种的GRF1蛋白均含有QLQ、WRC两个结构域；VvMIR396(VvmiR396的前体基因)和VvGRF1的启动子上都有多种激素(生长素、赤霉素、脱落酸等)响应元件。定量结果表明：在‘京可晶’种子败育过程中，VvmiR396的表达量逐渐升高，且在败育关键期(花后42 d)表达量最高，而VvGRF1呈现相反表达模式；在有核品种‘魏可’种子发育中，VvmiR396表达量呈下降趋势，在花后42 d表达量最低，靶基因的表达模式相反，表明VvmiR396可能介导VvGRF1正调控葡萄种子败育，而负调控种子的发育。进一步相关性分析发现，‘京可晶’种子败育中VvmiR396b与VvGRF1的负相关性最高。[结论]在假单性结实葡萄‘京可晶’中，鉴定到VvmiR396a、VvmiR396b、VvmiR396c、VvmiR396d共4个成员；VvmiR396b-VvGRF1可能是参与调控葡萄种胚败育的重要模块。

关键词

葡萄 / VvmiR396 / GRF / 假单性结实 / 种胚败育