猪卵泡发育过程中颗粒细胞内参基因表达稳定性分析

摘要

[目的]本研究旨在分析猪卵泡发育不同阶段颗粒细胞中内参基因的表达稳定性，筛选有效内参基因用于鉴定猪卵泡发育关键调控基因及其表达模式。[方法]基于形态学观察与类固醇激素检测分离猪腔前、有腔、成熟和闭锁卵泡，并收集相应颗粒细胞；利用RT-qPCR检测甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、β-肌动蛋白(ACTB)、ATP合酶F1(ATP5F1)、β2-微球蛋白(B2M)、真核翻译伸长因子1α(EEF1A1)、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(HPRT1)、核糖体蛋白S3(RPS3)、微管蛋白α-1b(TUBA1B)和泛素C(UBC)等9个候选内参基因在猪卵泡不同发育阶段颗粒细胞中的表达水平；综合ΔCt、geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder等算法分析候选内参基因在猪卵泡发育过程中的表达稳定性。[结果]候选内参基因在猪卵巢颗粒细胞中的表达水平存在较大差异，其中EEF1A1和TUBA1B的表达水平较高，而HPRT1和UBC的表达水平较低；不同算法得到的稳定性存在差异，用ΔCt、NormFinder和BestKeeper分析发现RPS3和ATP5F1的稳定性较高，用geNorm分析发现GAPDH和HPRT1的稳定性较高，最终利用RefFinder进行综合权重分析得出候选内参基因的稳定性从高到低依次为RPS3、ATP5F1、HPRT1、EEF1A1、GAPDH、ACTB、TUBA1B、B2M、UBC。进一步以不同表达稳定性内参基因为参照对母猪繁殖力候选基因FSHR和NORFA在卵泡发育过程中的表达模式进行检测，结果表明内参基因稳定性对准确鉴定目的基因表达水平和变化模式至关重要。[结论]RPS3和ATP5F1在猪卵泡发育过程中具有较高的表达稳定性，可作为有效内参基因用于后续猪卵泡发育相关研究，为鉴定猪卵泡发育关键调控基因及其表达模式等相关内参基因研究提供理论依据。

关键词

猪 / 卵泡发育 / 卵巢颗粒细胞 / RT-qPCR / 内参基因 / 表达稳定性分析