尖孢镰刀菌西瓜专化型RPA检测方法的建立与评价

摘要

[目的]构建了西瓜枯萎病菌——尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum f. sp.niveum,FON)的重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification, RPA)的快速检测体系，以期为田间西瓜枯萎病的快速检测提供技术支持。[方法]从NCBI网站下载包括西瓜枯萎病菌在内的11种病原真菌的基因组序列，利用SeqHunter 2软件进行生物信息学分析，经比对得到4个FON的特异性基因片段，并对其进行引物设计和筛选。利用聚合酶链式反应(PCR)验证引物的特异性和灵敏度，然后利用建立的RPA检测体系对引物的特异性和灵敏度进行验证，最后进行人工接种FON的西瓜植株的RPA检测与评价。[结果]建立了FON的RPA检测体系，并对DNA恒温快速扩增试剂盒的扩增体系进行最佳反应时间(40 min)和最适反应温度(30℃)的摸索，得到其最佳反应体系的检测下限为100 pg·μL~(-1)。利用DNA恒温快速扩增试剂盒(胶体金试纸条型)进行扩增时，只需在38℃反应12 min,取50μL稀释20倍的扩增产物用胶体金试纸条进行检测，5 min后即可进行结果的判断，检测下限为100 pg·μL~(-1)。[结论]成功构建FON的RPA检测体系，且建立的RPA检测体系能够从温室接种FON之后未显症的西瓜植物组织基因组DNA中检测到FON,可为田间西瓜枯萎病早期的快速检测提供技术支持。

关键词

西瓜枯萎病 / 尖孢镰刀菌西瓜专化型 / 重组酶聚合酶扩增技术(RPA) / 快速检测

基金资助

中央高校基本业务费专项资金(KYZZ2022001); 江苏省重点研发计划项目(BE2021364)