利用胞嘧啶碱基编辑器高效制备奶牛BLG基因敲除胚胎的研究

摘要

[目的]β-乳球蛋白是由BLG基因编码的蛋白质，是牛乳中主要的过敏原。本试验旨在使用优化后的单碱基编辑器（CBE）YE1-BE3-FNLS和YE1-AncBE4max对牛胚胎BLG基因进行单碱基编辑，同时对2种单碱基编辑器在牛胚胎BLG基因敲除效果进行评价。[方法]在奶牛的BLG基因的第一外显子上设计sgRNA序列，通过胞嘧啶碱基编辑器将BLG基因第21位密码子CAG突变为TAG,实现c^*.61C>T（p.Q21^*）的转变，获得终止密码子，使蛋白质翻译提前终止，达到基因敲除的目的。通过体外转录获得sgRNA以及YE1-BE3-FNLS和YE1-AncBE4max的mRNA,显微注射到奶牛胚胎中，收集囊胚，分别检测20枚YE1-BE3-FNLS编辑囊胚和24枚YE1-AncBE4max编辑囊胚，进行胚胎基因组PCR扩增，扩增BLG基因目标序列并进行测序验证编辑效率。根据sgRNA的序列，全基因组选择错配碱基最少的5个潜在脱靶位点进行脱靶检测。[结果]囊胚靶向编辑效率检测结果表明，YE1-AncBE4max对牛胚胎BLG基因的靶向编辑效率为83.3%（20/24）高于YE1-BE3-FNLS的靶向编辑效率60%（12/20）,而前者存在较大的编辑窗口（C1-C9）,可对sgRNA序列上的多个胞嘧啶进行编辑，后者具有较小的编辑窗口C2-C4;另外，YE1-BE3-FNLS具有较高的靶位点双链编辑效率35%（7/20）,而YE1-AncBE4max只有2枚编辑胚胎发生双链编辑，纯合编辑率较低；2种单碱基编辑器制备的编辑胚胎均未出现插入缺失和脱靶效应。[结论]本文使用的2种胞嘧啶碱基编辑器均能高效制备奶牛BLG基因编辑胚胎，为进一步获得BLG基因单碱基敲除奶牛储备技术方法。

关键词

单碱基编辑 / 奶牛 / BLG基因 / 胚胎