Cas9和PE介导湖羊骨骼肌卫星细胞MSTN基因敲除的研究

摘要

[目的]本文利用CRISPR/Cas9系统和先导编辑(prime editor, PE)对湖羊骨骼肌卫星细胞中的肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因外显子进行敲除，旨在比较2种技术敲除MSTN基因的效率，以验证新型基因编辑工具PE用于湖羊骨骼肌卫星细胞上的可行性。[方法]针对湖羊MSTN基因的3个外显子分别设计向导RNA(single guide RNA,sgRNA)以及引导RNA(prime editing guide RNA,pegRNA),构建相应的质粒后将含有Cas9/sgRNA或PE/pegRNA的质粒共同转染湖羊骨骼肌卫星细胞。24 h后观察细胞荧光，48 h后再将细胞消化，使用流式细胞分选仪根据荧光强度筛选出转染成功的强阳性细胞，收集细胞，获得基因组DNA后进行桑格测序，检测2种基因编辑工具对MSTN基因的打靶效率。[结果]成功构建了分别针对湖羊骨骼肌卫星细胞MSTN基因3个外显子敲除的基因编辑工具，质粒测序结果显示序列插入正确；CRISPR/Cas9的编辑效率(65%、88%、91%)显著高于PE的编辑效率(57%、29%、33%),而PE的插入缺失率显著低于CRISPR/Cas9。[结论]在转染效率相近的情况下，CRISPR/Cas9相比于PE对于湖羊骨骼肌卫星细胞MSTN基因的敲除有更高的编辑效率。

关键词

基因编辑 / CRISPR/Cas9 / 先导编辑(PE) / MSTN / 湖羊 / 骨骼肌卫星细胞