表达绿色荧光蛋白的A型人源呼吸道合胞病毒反向遗传系统的构建

摘要

[目的]为了更好地研究人呼吸道合胞病毒(HRSV)的发病机制并为其应用性研究提供便利，本研究构建了人源HRSVA2毒株的反向遗传操作系统，并将绿色荧光蛋白(GFP)插入HRSV-A2基因组中，构建表达GFP的重组HRSV-A2。[方法]以细菌人工染色体(BAC)为载体骨架构建HRSV-A2毒株全长质粒，并以此为基础在P与M基因之间插入GFP基因;以p CI为载体构建分别表达HRSV N、P、M2-1和L蛋白的4个辅助质粒，并将5个质粒共转染于表达T7 RNA聚合酶的BHK21-T7细胞系进行病毒拯救。[结果]提取r BAC-RSV-A2重组病毒和表达绿色荧光的r BAC-RSV-A2-P-GFP-M重组报告病毒RNA，通过RT-PCR进行全基因组测序，结果表明重组病毒构建成功;在F1—F9连续传代过程中均有绿色荧光表达，F10代荧光消失且无细胞病变;测定重组病毒的生长曲线结果表明，2株重组病毒的生长趋势与原始毒的生长趋势大致相同，表明插入外源基因并不会改变病毒本身的生长特性;噬斑观察及染色结果显示，重组病毒的噬斑小于亲本病毒，表明重组病毒增殖水平下降。[结论]本研究成功构建了以BAC载体为骨架的HRSV-A2感染性克隆，获得了可以表达GFP的重组HRSV病毒。该研究所建立的高效、稳定的HRSV反向遗传学系统，为HRSV致病机制研究、疫苗和抗体药物研发提供了有益的技术平台。

关键词

人呼吸道合胞病毒 / 绿色荧光蛋白 / 反向遗传系统 / 重组病毒