鹅源NDV基因Ⅶ型致弱株的构建及其生物学特性

摘要

[目的]本试验基于分离得到的一株鹅源基因Ⅶ型新城疫病毒(NDV-QY)株利用定点突变的方法致弱成为弱毒疫苗株载体并对其进行生物学特性评价。[方法]运用同源重组将亲本株NDV-QY的全基因组分为7个节段并依次连接至细菌人工染色体(BAC)中，构建含有NDV-QY全长的cDNA感染性克隆，将其与可表达NDV NP、P、L蛋白的辅助质粒PPL-16于表达T7 RNA聚合酶的BHK细胞中共转染获得了未改造株rNQY。设计引物并运用定点突变的方法使经典NDV的速发型/强毒株F蛋白裂解位点氨基酸序列突变为LaSota弱毒株序列，获得鹅源基因Ⅶ型NDV致弱株载体rNQY-FTB。对rNQY-FTB在BHK-21及DF-1细胞上作细胞培养特性测定、并在鸡胚中进行生物学特性测定、鸡胚胚体发育及组织病理学比对，使用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测亲本(NDV-QY)组、致弱突变(rNQY-FTB)组、对照组(无菌生理盐水)鸡胚组织中病毒载量情况，并于1日龄SPF雏鸡上进行安全性及免疫原性评价。[结果]qPCR结果显示，NDV-QY组及rNQY-FTB组受试鸡胚肠、气管、胃、脑均检出病毒，但致弱突变组鸡胚组织中病毒载量总体低于亲本组，且肠组织中病理损伤极为轻微，无菌生理盐水对照组各组织均未检出；生物学特性结果显示该致弱毒株F蛋白裂解位点氨基酸序列由强毒序列突变为弱毒序列后其毒力明显减弱，改造的rNQY-FTB在鸡胚中的生长滴度、生长趋势与亲本株无明显差异，且该突变序列可稳定遗传10代以上。在1日龄SPF鸡上的免疫试验结果显示，该致弱株具有良好的免疫原性及安全性。[结论]本研究中成功构建的NDV致弱株为NDV活病毒载体平台的建立及其黏膜免疫疫苗的研制奠定了良好基础。

关键词

鹅源 / 新城疫病毒基因Ⅶ型 / 反向遗传系统 / 致弱 / 定点突变