基于网络药理学和分子对接探讨化坚消核散治疗单纯性乳房早发育的作用机理

摘要

目的 基于网络药理学和分子对接技术预测化坚消核散治疗单纯性乳房早发育（SPT）的核心靶点和作用通路。 方法 运用TCMSP、BATMAN-TCM数据库筛选化坚消核散活性成分及对应靶点基因，于GeneCards、OMIM数据库检索SPT相关疾病靶点，借助微生信平台获取药物与疾病交集靶点；利用Cytoscape 3.10.4软件构建“中药-活性成分-交集靶点”调控网络与蛋白质-蛋白质互作（PPI）网络，筛选主要活性成分与核心靶点；采用Metascape平台开展基因本体（GO）功能注释和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，并运用分子对接技术验证主要活性成分与核心靶点的结合活性。 结果 共筛选得到化坚消核散活性成分449个、靶点基因1 831个和SPT疾病相关靶点316个，获得交集靶点59个；经网络拓扑学分析筛选出槲皮素、维生素D3、β-谷甾醇、姜黄素和油酸5个主要活性成分，以及雌激素受体1（ESR1）、胰岛素（INS）、白细胞介素-6（IL-6）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）、雄激素受体（AR）、转化生长因子-β1（TGF-β1）、瘦素（LEP）等13个核心靶点。富集分析结果显示，核心靶点主要参与蛋白修饰过程的调控、女性性别分化等生物学过程，显著富集于雌激素信号通路、MAPK信号通路等通路；分子对接结果表明，结合活性稳定且结合效果较好。 结论 化坚消核散通过“多成分-多靶点-多通路”的方式，调节性激素受体、改善内分泌失衡、抑制乳腺异常增殖与炎症反应，从而发挥治疗SPT的作用，为其临床应用提供了分子依据，但其相关预测仍需体内外实验进一步验证。

Graphical abstract

关键词

单纯性乳房早发育 / 化坚消核散 / 网络药理学 / 分子对接

单纯性乳房早发育（simple premature thelarche，SPT）是儿童期最常见的不完全性性早熟之一，以7.5岁前女童单侧或双侧乳房增大为核心表现，无其他第二性征，近年在临床上越来越常见，成为儿科临床关注热点^［1］。西医对SPT发病机制尚未完全明确，可能与下丘脑-垂体-性腺轴（HPG轴）的暂时激活、环境内分泌干扰物暴露等因素相关^［2-3］，临床多以随访观察为主，但15%左右SPT患儿会发展为中枢性性早熟（central precocious puberty，CPP）^［4-5］。

全国名老中医药传承工作室专家郑健教授认为性早熟以肾阴亏虚、虚火上炎为核心病机，艾斯教授传承其学术思想，自拟化坚消核散以发挥滋阴降火、化痰散结的功效。前期临床研究显示，化坚消核散可显著降低SPT女童性激素水平与中医证候积分，有效改善性早熟儿童乳房早发育情况^［6］。本研究采用网络药理学结合分子对接技术，筛选化坚消核散主要活性成分及核心作用靶点，验证其结合能力，阐明该方剂治疗SPT的作用机理，为其临床应用提供科学依据。

1 资料和方法

1.1 获取化坚消核散活性成分及药物靶点

通过TCMSP数据库（https：//www.tcmsp-e.com/tcmsp.php）、BATMAN-TCM数据库（http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）获取化坚消核散组成药物的活性成分，检索化坚消核散中知母、生地黄、黄柏、山茱萸、陈皮、法半夏、莪术、橘核、茯苓、鳖甲、牡丹皮、山药、麦芽的活性成分及药物靶点。在TCMSP数据库以生物口服利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18为筛选条件；在BATMAN-TCM数据库中以Score cutoff ≥0.95且P≤0.05为筛选条件。将2个数据库得到的药物活性成分的靶点取并集、去重后提交至UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/），限定物种为智人（Homo sapiens），查询靶点蛋白所对应的基因名称。

1.2 筛选SPT疾病靶点

在GeneCards（https：//www.genecards.org/）以及OMIM数据库（https：//www.omim.org/）中进行人类基因检索。在搜索栏中选择限制条件为“Diseases”，然后在检索栏中输入“Simple Premature Thelarche”，分别将2个数据库搜索的基因下载保存并去重，并利用Uniprot数据库将基因名称转化为“OFFICIAL SYMBOL”。将上述疾病靶点合并、去重，得到SPT疾病靶点。

1.3 化坚消核散与SPT交集靶点获取

应用微生信平台（http：//bioinformatics.com.cn/keywords=pathway）将化坚消核散药物靶点及SPT疾病靶点进行交集分析，获得交集靶点数据，并根据结果绘制韦恩图。

1.4 构建“中药-活性成分-交集靶点”调控网络和蛋白互作网络

将中药、活性成分和交集靶点等信息导入Cytoscape 3.10.4平台中，构建“中药-活性成分-交集靶点”网络图，并以拓扑分析获取网络图的相关数据，根据度值大小筛选主要活性成分。将化坚消核散药物成分靶点与SPT靶点的交集靶点导入STRING数据库（https：//string-db.org/），生物种类设为Homosapiens，构建蛋白质-蛋白质互作（PPI）网络；利用Cytoscape 3.10.4软件插件分析交集靶点，获得核心网络，通过分析节点的介数中心性、紧密中心性、度中心性等拓扑学属性，筛选出药物核心靶点。

1.5 生物信息学分析

将取交集后的化坚消核散成分与SPT相关的基因靶点导入Metascape数据库中进行基因本体（GO）功能注释和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，并采用在线作图工具微生信绘制结果气泡图。

1.6 分子对接

首先获取小分子配体文件，在PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载化坚消核散中度值（Degree）排名前5位的活性成分3D结构SDF文件。其次通过RCSB-PDB数据库（https：//www.rcsb.org）获得核心靶蛋白的3D结构PDB文件。将上述处理后的结构文件上传至CB-Dock2平台（https：//cadd.labshare.cn/cb-dock2/index.php），对Degree值筛选得到的核心靶点与主要活性成分进行分子对接模拟，对接结果采用Pymol软件进行可视化呈现。

2 结　果

2.1 化坚消核散药物靶点与SPT疾病靶点筛选

经筛选共获得化坚消核散药物活性成分449个、靶点基因1 831个和SPT疾病靶点316个。将化坚消核散药物靶点与SPT疾病靶点进行交集分析，并绘制韦恩图，最终得到二者共同交集靶点59个。见图1。

2.2 构建“中药-活性成分-交集靶点”调控网络

将上述获得的中药、活性成分、交集靶点等信息导入Cytoscape 3.10.4软件，进行网络拓扑学分析，并绘制“中药-活性成分-交集靶点”网络图，见图2。其中Degree值排名前5的主要活性成分为槲皮素、维生素D3、β-谷甾醇、姜黄素和油酸，见表1。

2.3 构建蛋白互作网络

将59个交集靶点导入STRING数据库进行蛋白互作分析，再将数据文件导入Cytoscape 3.10.4软件，构建PPI网络图，见图3。通过CytoNCA插件计算得到网络中节点的介数中心性、紧密中心性、度中心性，以介数中心性、紧密中心性、度中心性≥中位数作为筛选规则，进行2次筛选后得到的靶点作为化坚消核散治疗SPT的核心靶点，最终确定13个核心靶点包括TGF-β1、EP300、LEP、ESR2、IGF-1、INS、IL-6、ESR1、AR、EZH2、PGR、NOTCH1、FGFR1，见表2。

2.4 GO功能注释及KEGG富集通路分析

GO功能选取生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF），根据校正后P值筛选出前20名应用微生信平台绘制柱状图，见图4。BP主要涉及蛋白修饰过程的调控、女性性别分化、对雌二醇的反应等方面；CC主要涉及内质网腔、分泌颗粒腔、细胞质囊泡腔等方面；MF主要涉及转录辅调节因子活性、转录共激活因子结合、转录辅调节因子结合等方面。KEGG富集分析结果显示，预测靶点主要富集在通路中的癌症、乳腺癌、癌症中的蛋白聚糖等，提示其可能通过调控激素信号、雌激素应答、细胞增殖与分化相关通路发挥作用，见图5。

2.5 分子对接结果

配体与受体之间的结合能是评价结合能力的重要指标，一般认为配体与受体的结合能越低，构象越稳定，以结合能≤-5.0 kcal/mol为标准。分子对接结果见图6和表3，槲皮素与IGF-1通过多氢键形成稳定复合物，可占据蛋白相关位点干扰受体结合；槲皮素与IL-6形成多个强氢键，提升结合亲和力并可能抑制炎症信号通路；油酸以羧基为核心与AR形成关键氢键，结合口袋更深且依赖极性基团精准定位，可竞争性抑制AR功能；槲皮素与TGF-β1形成多点氢键网络，结合特异性高，可干扰其与受体相互作用；槲皮素通过多级氢键与LEP关键残基稳定结合，空间互补性良好。

3 讨　论

SPT作为儿童常见且具进展性的内分泌疾病，其发病机制呈现多因素交织的特点，包括HPG轴暂时性激活、局部乳腺组织对雌激素敏感性异常升高、代谢紊乱及慢性炎症等病理环节。SPT属中医“乳疬”范畴，其核心病机为阴虚火旺，兼夹痰湿壅盛。小儿为稚阴稚阳之体，肾阴不足则相火妄动，脾虚失健、水湿内停聚而成痰，痰火相合，壅滞乳络，最终导致乳房异常增大。围绕核心病机，艾斯教授提出滋阴降火、化痰散结的核心治则，方予化坚消核散治疗。该组方是由知柏地黄丸和二陈汤化裁而来，全方标本兼顾，切中SPT“阴虚火旺、痰湿壅盛”之核心病机。方中知母、生地黄为君，滋阴降火，直折相火之妄动；黄柏清热燥湿，清泻下焦虚火；山茱萸、山药滋补肾阴以壮水制火；牡丹皮清热凉血，助降虚火；鳖甲滋阴潜阳，软坚散结；茯苓、陈皮、法半夏健脾化痰，理气散结，共为臣药；橘核理气散结、止痛；莪术破血行气止痛，共为佐药；麦芽为佐使，疏肝回乳，引药归经，并顾护脾胃，调和诸药。全方滋阴与降火并行，化痰与散结兼顾，既从源头上抑制相火妄动，又从局部消散已成之痰结，体现了“多药协同、多成分共效”的配伍特点，使其滋阴而不滋腻，燥湿而不伤阴，破血而不伤正，理气而不耗气。现代研究表明黄柏中所含的槲皮素可拮抗雌激素受体活性，抑制乳腺上皮细胞增殖^［7］；牡丹皮活性成分与槲皮素协同发挥抗炎作用^［8］；陈皮中提取的川陈皮素可调控PI3K/Akt、丝裂原活化蛋白激酶通路（MAPK）及雌激素等信号通路^［9］；甘氨酸和姜黄素为鳖甲-莪术的关键活性成分，可通过调控细胞自噬发挥抗炎及抑制增殖作用^［10］。

本研究利用网络药理学共筛选出化坚消核散449个有效活性成分，其中槲皮素、维生素D3、β-谷甾醇、姜黄素、油酸为度值排名前5的主要活性成分，这些成分广泛分布于黄柏、陈皮、莪术、麦芽等药味中，构成该复方发挥作用的核心物质基础。槲皮素作为关联靶点最多的活性成分，可通过直接结合ESR1抑制乳腺上皮细胞增殖，同时下调IL-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎症因子表达^［8］；维生素D3参与性发育调控及卵巢类固醇生成^［11］，其缺乏已被证实与SPT的发生及向CPP进展密切相关，可通过调控IGF-1信号通路，延缓性发育进程^［12］；β-谷甾醇与姜黄素侧重炎症调控与信号通路干预，前者可抑制NOD样受体蛋白3（NLRP3）炎症小体活化，阻断MAPK激活以减少促炎因子释放^［13］，后者通过抑制核因子-κB（NF-κB）磷酸化，上调核因子E2相关因子2（Nrf2）表达，减轻乳腺组织氧化应激与炎症损伤^［14］；油酸作为不饱和脂肪酸，可调节脂代谢与胰岛素敏感性，针对SPT患儿常见的肥胖、代谢紊乱等危险因素发挥辅助调控作用^［15］。

根据拓扑学分析共筛选出化坚消核散的13个核心靶点，按功能可聚类为性激素受体、生长发育与代谢、炎症与信号调控三类，且存在紧密的互作关系。其中，性激素受体靶点如ESR1、ESR2、AR、PGR是SPT病理调控的核心。ESR1与ESR2介导雌激素对乳腺发育的调控，AR通过芳香化途径间接影响HPG轴功能^［16］，PGR则调控乳腺导管增殖^［17］，核心成分槲皮素、维生素D3与ESR1的结合能分别达-8.5 kcal/mol、-9.9 kcal/mol，提示化坚消核散可能通过竞争性结合性激素受体，抑制异常雌激素信号传导，从源头阻断乳腺组织过度刺激；生长发育与代谢靶点如IGF-1、LEP、INS参与青春期启动。其中IGF-1通过分阶段调控促性腺激素释放激素（GnRH）分泌推动青春期提前启动^［18］，LEP与INS则通过调控能量代谢与HPG轴活性参与SPT发病^［19-20］，核心成分槲皮素与IGF-1、TGF-β1的结合能均较高，可能通过抑制此类靶点活性，延缓性发育进程、改善代谢紊乱；炎症与信号调控靶点如IL-6、EP300、EZH2、NOTCH1、FGFR1参与慢性炎症反应，IL-6作为核心促炎因子，可通过放大下丘脑神经炎症激活HPG轴^［21］，EP300与EZH2通过表观遗传调控青春期启动基因表达^［22-23］，NOTCH1与FGFR1则介导乳腺上皮细胞分化与增殖^［24-25］，活性成分姜黄素、β-谷甾醇可能通过调控这些靶点，减轻局部炎症、抑制细胞异常增殖。

GO与KEGG富集分析进一步揭示了核心靶点的生物学功能与通路特征。GO功能富集显示，核心靶点主要参与腺体发育、上皮细胞增殖、MAPK级联反应调控等生物学过程，涉及类固醇结合、激素活性、信号受体调节因子活性等分子功能，直接对应SPT乳腺异常发育的核心病理；细胞组分主要富集于异染色质、细胞外基质、组蛋白甲基转移酶复合物等，与靶点的表观遗传调控、细胞间信号传导功能密切相关。KEGG通路富集分析显示，核心靶点主要富集于雌激素信号通路、MAPK信号通路、PI3K/Akt信号通路、卵巢类固醇生成通路、内分泌抵抗通路等关键通路，且存在明确的上下游调控关系。雌激素信号通路为SPT关键通路，其异常激活可提高乳腺组织对雌激素的敏感性，化坚消核散可能通过调控雌激素信号通路下调ERα表达，抑制乳腺异常增殖^［26］。MAPK与PI3K/Akt通路是调控细胞增殖分化的重要通路，IGF-1高表达可激活上述通路，β-谷甾醇、姜黄素可通过抑制MAPK磷酸化、阻断PI3K/Akt通路，逆转乳腺细胞过度增殖。维生素D可通过其核受体（VDR）介导的信号通路，参与调控卵巢局部类固醇生成、颗粒细胞功能和卵泡发育过程^［11］。同时，激素信号通路与内分泌抵抗通路可共同恢复乳腺正常发育节律。

分子对接结果进一步验证了网络药理学预测的可靠性，5个活性成分与7个核心靶点结合能均为负值，可自发稳定结合。其中维生素D3、β-谷甾醇与ESR1结合能最低，为拮抗雌激素受体的关键物质；槲皮素可同时作用于AR、IL-6、TGF-β1等靶点，实现多靶点调控；姜黄素、β-谷甾醇对MAPK通路相关靶点结合活性显著，与其抑制细胞增殖的作用一致。

综上，本研究构建了“中药活性成分-核心靶点-信号通路”调控网络，阐明化坚消核散通过调节性激素受体，改善内分泌失衡，抑制乳腺异常增殖与炎症反应发挥治疗作用，为临床应用提供了分子依据。本研究仍存在一定局限，相关预测有待体内外实验进一步验证。

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基金资助

国家卫生健康委员会专项研究（儿科和药学方向）(GWJJZX20251001007)

国家中医药管理局全国名老中医药专家传承工作室建设项目(国中医药人教函〔2022〕75号)

福建中医药大学校管课题优势学科专项（X2022001-专项）