实时荧光定量PCR法检测左旋多巴中大肠埃希菌宿主细胞DNA残留量

许冰瑜; 刘妍; 郭心瑶; 严方; 孙桂斌

中国药科大学学报 ›› 2025, Vol. 56 ›› Issue (2) : 176 -182.

许冰瑜, 刘妍, 郭心瑶, 严方, 孙桂斌

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摘要

采用实时荧光定量PCR技术，建立特异性强、灵敏度高的左旋多巴中大肠埃希菌（Escherichia coli）宿主细胞DNA残留量的检测方法，并进行验证和初步应用。以大肠埃希菌中的相对保守的E. coli MB6菌株16S核糖体RNA基因序列作为目的基因设计多对引物，通过PCR进行特异性扩增获得目的片段。将目的片段重组至pLENTI-BSD-CON载体构建重组质粒命名为pLENTI-BSD-CON-E.coli-16S，以其为标准品，结合磁珠法提取纯化DNA，建立定量PCR检测方法（SYBRGreen法）。对建立的方法进行线性与范围、准确度、精密度、专属性、定量限及耐用性的方法学验证，应用于左旋多巴原料药的检测，并与试剂盒检测方法（Taqman探针法）进行比较。建立的定量PCR检测方法（SYBR-Green法）正向引物序列：5'-TTCGATGCAACGCGAAGAAC-3'；反向引物序列：5'-GTGTAGCCCTGGTCGTAAGG-3'。以重组质粒作为标准品，DNA质量浓度在10 fg/μL～3 ng/μL范围内线性关系良好（R²≥0.98），定量限为10 fg/μL，加标溶液回收率在59.7%～80.7%范围内，RSD均小于30%。应用该法对3批左旋多巴原料药进行检测，DNA残留量均在限度以下。结果表明，建立的检测方法可用于定量检测左旋多巴等由大肠埃希菌作为宿主细胞生产的生物制品的DNA残留量，并且其灵敏度优于试剂盒检测方法。