小分子化合物Lyb24与二氢乳清酸脱氢酶PyrD的相互作用研究

摘要

本研究旨在探索小分子化合物Lyb24与肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae,KP）嘧啶生物合成途径关键酶PyrD之间的相互作用以及Lyb24对PyrD酶催化活性的影响，为新型抗菌药物的开发提供理论依据。实验通过NdeⅠ/XbaⅠ双酶切技术构建pET-30a（+）-PyrD重组质粒，并利用热激法将其转化至大肠埃希菌BL21（DE3）感受态细胞。在0.3 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG）诱导下，于16℃条件下诱导重组蛋白表达。采用镍-氮三乙酸（nickel-nitrilotriacetic acid,Ni-NTA）亲和色谱法纯化重组PyrD蛋白，获得高纯度产物。通过表面等离子共振（surface plasmon resonance,SPR）实验检测Lyb24与PyrD蛋白之间的直接相互作用，并利用基于2,6-二氯酚靛酚的比色法评估Lyb24对PyrD催化活性的影响。实验成功构建了pET-30a（+）-PyrD质粒，表达并纯化出浓度为5.58mg/mL的相对分子质量约为36 kD的重组PyrD蛋白。Lyb24与PyrD能够发生高亲和力的直接结合(K_D=8.83×10^-5mol/L)，且Lyb24对PyrD的酶活性具有反竞争性抑制作用。本研究揭示了小分子化合物Lyb24可与PyrD发生直接结合，以及对其功能的抑制作用，为开发以PyrD为靶点的新型抗菌制剂提供了重要的实验依据和数据支持，具有潜在的临床应用价值。

关键词

肺炎克雷伯菌 / 抑制剂 / Lyb24 / PyrD / 机制研究

基金资助

深圳市呼吸系统疾病临床医学研究中心课题(LCYSSQ20220823091203007)