TRIF敲除NA与BHK-21细胞系的构建及对狂犬病病毒增殖效率的影响

摘要

【目的】通过CRISPR/Cas9技术构建β干扰素TIR结构域衔接蛋白(TIR-domain-containing adaptorinducing interferon β,TRIF)基因敲除小鼠NA细胞系与仓鼠BHK-21细胞系，评估狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)在敲除细胞系中的增殖能力，探究TRIF在RABV感染过程中的功能。【方法】首先，设计单向导RNA(Single guide RNA,sgRNA)，构建用于TRIF基因敲除的重组质粒pSpCas9-NA-TRIF-KO和pSpCas9-BHK-21-TRIF-KO，将重组质粒转染野生型NA与BHK-21细胞，通过嘌呤霉素初步筛选阳性细胞，并使用有限稀释法获得单细胞亚克隆。随后，对筛选的细胞扩大培养，并通过PCR扩增、测序以及Western blot鉴定，最终筛选TRIF敲除NA与BHK-21细胞系。最后，将RABV标准攻击毒株CVS-11与疫苗毒株BNSP-SAD分别接种TRIF敲除细胞系与野生型细胞系，通过Western blot检测病毒N蛋白的表达水平，并利用TCID50检测病毒滴度，以评估RABV在不同细胞系中的增殖能力。【结果】成功构建了用于TRIF基因敲除的重组质粒pSpCas9-NA-TRIF-KO与pSpCas9-BHK-21-TRIF-KO，并筛选鉴定出TRIF基因敲除NA细胞系与BHK-21细胞系。与野生型细胞系相比，2种TRIF敲除细胞系接种RABV CVS-11与BNSP-SAD后，N蛋白的表达量均在感染24 h后明显升高，病毒滴度同样均在感染24 h后显著上升。【结论】相较于野生型细胞系，RABV在TRIF基因敲除细胞系中的增殖能力更优，TRIF可能具有抑制病毒复制的能力。研究结果为深入研究TRIF功能提供了有力支持，也为RABV的培养与研究提供了新的细胞模型。

关键词

CRISPR/Cas9 / β干扰素TIR结构域衔接蛋白基因 / 基因敲除 / 狂犬病病毒