过表达VIM基因的LMH细胞系构建及对GAstV增殖效率的影响

摘要

【目的】构建稳定过表达波形蛋白(Vimentin,VIM)基因的鸡肝癌(Leghorn male hepatoma,LMH)细胞系以提高鹅星状病毒(Goose astrovirus,GAstV)增殖效率。【方法】从鹅源细胞中通过PCR扩增VIM基因，结合同源重组的方法将其连接至慢病毒基因过表达系统载体pLV-sfGFP (2A) Puro，获得重组慢病毒质粒pLV-sfGFP(2A) Puro-VIM-Flag(pLV-VIM)；利用293T细胞包装重组慢病毒颗粒，随后感染LMH细胞，并利用嘌呤霉素进行筛选以获得目标细胞；通过Western blot、RT-qPCR、间接免疫荧光试验和TCID50测定等方法评估VIM对GAstV增殖效率的影响；最后通过抗体阻断试验分析细胞表面VIM对GAstV侵入的影响。【结果】经测序和酶切鉴定，成功构建了重组慢病毒载体pLV-VIM；经筛选后获得了过表达VIM基因的LMH细胞系(LMHVIM)及其对照组细胞系(LMH-NC)。Western blot结果显示，LMH-VIM细胞中波形蛋白的表达水平显著高于LMH-NC。接种病毒后发现，过表达VIM显著上调LMH-VIM细胞中GAstV的mRNA和蛋白表达水平，以及细胞上清液中的病毒滴度。抗体阻断试验表明，细胞表面VIM可促进GAstV侵入细胞。【结论】本研究为提高GAstV在体外细胞培养的增殖滴度提供了新的见解和思路，对GAstV感染引起的雏鹅痛风疾病的疫苗研发、生产和该疾病的防控具有重要意义。

关键词

波形蛋白基因 / 鸡肝癌细胞系 / 基因过表达 / 鹅星状病毒 / 增殖效率