羊栖菜多酚抗氧化及细胞损伤保护作用研究

Study on antioxidant and cell damage protection effects of Sargassum fusiforme polyphenols

摘要

目的 探究羊栖菜多酚的体外抗氧化活性及对H₂O₂诱导的人血管内皮细胞（Human aortic endothelial cells，HAECs）损伤的保护作用，为其在功能性食品及医药领域的应用开发提供理论依据。 方法 以羊栖菜为原料，采用60%乙醇溶液提取多酚类化合物，经石油醚脱脂、硅胶柱层析法纯化获得羊栖菜多酚。通过测定其对1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、超氧阴离子（Superoxide anion，O₂⁻）自由基及2，2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS⁺）自由基的清除能力，评估其体外抗氧化活性。建立过氧化氢（H₂O₂）诱导的HAEC氧化损伤模型，考察羊栖菜多酚对氧化损伤HAEC存活率的影响，并分析其量效关系。 结果 羊栖菜多酚对3种自由基均表现出显著的清除能力，其半数抑制浓度（Half-maximal inhibitory concentration，IC₅₀）分别为：DPPH自由基0.074 mg·mL^-1、O₂⁻自由基0.069 mg·mL^-1、ABTS⁺自由基0.089 mg·mL^-1。在细胞实验中，羊栖菜多酚可浓度依赖性地修复H₂O₂诱导的HAEC氧化损伤，显著提高细胞存活率（P＜0.05）。 结论 羊栖菜多酚具有强效的体外抗氧化活性及明确的细胞保护作用，可应用于功能性食品或生物医药领域，以预防氧化应激相关疾病。

Abstract

Objective : Exploring the in vitro antioxidant activity of polyphenols from Sargassum fusiforme and their protective effects against H₂O₂-induced damage in human aortic endothelial cells （HAECs）， thereby providing a theoretical basis for their application and development in functional food and pharmaceutical fields. Methods Polyphenols from Sargassum fusiforme were extracted from Sargassum fusiforme with 60% ethanol， followed by defatted with petroleum ether and purification via silica gel column chromatography. The in vitro antioxidant capacity was assessed by measuring scavenging activities against 1， 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl （DPPH） radicals， superoxide anion （O₂⁻） radicals， and 2，2′-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid） （ABTS⁺） radicals. An oxidative damage model was established in HAECs induced by H₂O₂ to evaluate the effects of polyphenols from Sargassum fusiforme on cell viability and analyze the dose-response relationship. Results The polyphenols from Sargassum fusiforme showed significant scavenging ability to all three free radicals， and its half-maximal inhibitory concentration （IC₅₀） was： DPPH radical 0.074 mg·mL^-1， O₂⁻ radical 0.069 mg·mL^-1， ABTS⁺ radical 0.089 mg·mL^-1. In cellular experiments， polyphenols from Sargassum fusiforme alleviated H₂O₂-induced oxidative damage in HAECs in a concentration-dependent manner and significantly enhanced cell viability （P＜0.05）. Conclusion The polyphenols from Sargassum fusiforme exhibit potent in vitro antioxidant activity and obvious cytoprotection. They act as natural antioxidants for functional foods or biomedical applications to prevent oxidative stress-related diseases.

Graphical abstract

关键词

羊栖菜 / 多酚 / 抗氧化活性 / 细胞损伤

Key words

Sargassum fusiforme / Polyphenols / Antioxidant activity / Cell damage

氧化应激是细胞损伤和多种疾病发生发展的核心病理机制之一。在生理状态下，细胞内活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的产生与抗氧化防御系统维持动态平衡。然而，当机体遭受紫外线辐射、化学刺激或代谢紊乱等外界刺激时，ROS的过量积累会破坏氧化还原稳态，引发脂质过氧化、蛋白质变性及DNA损伤，最终导致细胞功能障碍甚至凋亡^［1-5］。研究表明，氧化应激与炎症、肿瘤、神经退行性疾病及心血管病变等密切相关；而天然抗氧化剂通过清除ROS或增强细胞抗氧化能力，已成为预防氧化损伤相关疾病的重要策略^［6-8］。

褐藻多酚是一类广泛存在于海洋藻类中的天然酚类化合物，因其独特的共轭结构和强抗氧化活性受到广泛关注。研究表明，褐藻多酚可通过清除自由基、螯合金属离子及调节抗氧化酶活性等途径，有效抵御紫外辐射和氧化应激对藻体的损伤，同时兼具降血糖、抗炎及心血管保护等生物活性^［9-11］。羊栖菜隶属于褐藻门，是马尾藻科马尾藻属植物，在中国沿海地区资源丰富，其富含的18种必需氨基酸及多酚类物质，赋予其显著的营养保健价值^［12］。

近年来，羊栖菜多酚的抗氧化功能逐渐成为研究热点。WANG Y等^［13］研究发现，乙醇-水体系可实现藻类细胞壁的高效破坏与抗氧化成分的稳定保留，乙醇提取物在总酚得率和抗氧化活性上显著优于甲醇提取物。WANG L等^［14］进一步证实，羊栖菜多酚可通过提升细胞内源性抗氧化剂水平，有效抑制H₂O₂诱导的Vero细胞氧化损伤。然而，目前有关羊栖菜多酚对H₂O₂诱导的人血管内皮细胞（Human aortic endothelial cells，HAECs）氧化损伤及其在细胞模型中保护机制的深入解析鲜见报道。鉴于此，本研究以羊栖菜为原料提取羊栖菜多酚，全面评价其体外抗氧化能力，并基于H₂O₂诱导的HAECs损伤模型，探究羊栖菜多酚对氧化损伤细胞存活率的影响，为其在功能性食品及医药领域的应用开发提供理论依据。

1 资料与方法

1.1　实验材料

1.1.1　药物和试剂

羊栖菜于2022年8月采自福建省漳浦县；HAEC细胞，北京鼎国生物；DMEM培养基，美国Gibco公司；胎牛血清，美国Hyclone公司；二甲基亚砜（DMSO）、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、维生素C、H₂O₂，美国Sigma公司；200～300目硅胶，国药集团化学试剂有限公司；96孔细胞培养板、细胞培养瓶，美国Costar公司；其他试剂均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2　设备和仪器

CO₂培养箱型号：NUAIR 550，美国Nuaire公司；荧光全自动酶标仪型号：SH-1000，日本Corona公司；真空干燥箱型号：DZF-6020，上海精宏实验设备有限公司；倒置光学显微镜型号：IDE2000，重庆光电仪器有限公司；超低温离心机型号：Z323K，德国Hermle公司；SENCO旋转蒸发仪型号：XMTF-6000，上海申生科技有限公司；自动分布收集器型号：BS-100A，上海沪西有限公司。

1.2　方法

1.2.1　羊栖菜多酚的提取制备

基于郑晓丽等^［15］、张丽斌等^［16］方法的基础上加以修改。取新鲜干净羊栖菜500 g，真空冷冻干燥得干燥物96.7 g，粉碎过60目筛。用200 mL 60%乙醇按料液比1∶20（m/V）于60 ℃浸提3次，每次3 h，过滤滤渣得到羊栖菜多酚粗提液。羊栖菜多酚粗提液减压浓缩去除乙醇后，用石油醚按体积比1∶1萃取2次去脂，收集水相部分。采用硅胶柱层析法纯化羊栖菜多酚粗提液，采用乙酸乙酯-甲醇体系梯度洗脱，柱身（32 mm×457 mm）装柱系数约0.6，洗脱流速1.0 BV·h^-1，初始洗脱溶剂比例为：乙酸乙酯/甲醇（50∶50，V/V）随后依次调整溶剂比例为乙酸乙酯-甲醇（40∶60，V/V）、（30∶70，V/V）及（20∶80，V/V），每个浓度洗脱时间为110 min。回收相应管洗脱液，经减压浓缩冷冻干燥后得到羊栖菜多酚，-20 ℃保存备用，使用时，用70%乙醇梯度稀释配置至所需的羊栖菜多酚浓度。

1.2.2　DPPH自由基清除能力的测定

参照BALIYAN S等^［17］、RUMPF J等^［18］相关研究方法并进行适当优化，测定羊栖菜多酚对DPPH自由基的清除能力，选取维生素C作为阳性对照组，实验组中样品质量浓度分别为：0.03、0.06、0.09、0.12、0.15 mg·mL^-1。利用分光光度计在517 nm波长下对吸光值进行精确测量，并依据相应公式计算出DPPH自由基清除率，并计算其半数抑制浓度（Half-maximal inhibitory concentration，IC₅₀），IC₅₀值越低，表明半抑制率（半清除率）越高。IC₅₀值计算公式如下：

\mathrm{I}{\mathrm{C}}_{\mathrm{50}}={\mathrm{D}}_{\mathrm{1}}+\frac{\left({\mathrm{D}}_{\mathrm{2}}-{\mathrm{D}}_{\mathrm{1}}\right)\times \left(\mathrm{50}-{\mathrm{P}}_{\mathrm{1}}\right)}{{\mathrm{P}}_{\mathrm{2}}-{\mathrm{P}}_{\mathrm{1}}}⑴

D₁表示抑制率（清除率）低于50%的浓度，D₂表示抑制率（清除率）高于50%的浓度，P₁表示D₁对应的抑制率（清除率），P₂表示D₂对应的抑制率（清除率）。

1.2.3　O₂⁻自由基清除能力的测定

测定羊栖菜多酚对O₂⁻自由基清除能力参照MAHENDRAN S等^［19］的方法，选取维生素C作为阳性对照组，实验组中样品质量浓度分别为：0.03、0.06、0.09、0.12、0.15 mg·mL^-1。利用分光光度计在320 nm波长下对吸光值进行精确测量，进而依据相应公式计算出O₂⁻自由基清除率。

1.2.4　ABTS⁺自由基清除能力的测定

参照MAHENDRAN S等^［19］的方法，测定羊栖菜多酚对ABTS⁺自由基的清除能力，选取维生素C作为阳性对照组，实验组中样品质量浓度分别为：0.03、0.06、0.09、0.12、0.15 mg·mL^-1。利用分光光度计在734 nm波长下对吸光值进行精确测量，进而依据相应公式计算出ABTS⁺自由基清除率。

1.2.5　MTT法检测羊栖菜多酚对正常HAEC的影响

参考苏晨等^［20］的方法，将HAEC细胞经复苏、培养、传代后，取处于稳定生长对数生长期的HAEC细胞以每孔100 μL（1×10⁵个/孔）加入96孔板中，放置5% CO₂、37 ℃培养箱孵育24 h。弃去上清液，正常对照组加入100 μL无血清DMEM培养基培养，实验组加入由无血清DMEM培养基溶解的不同浓度羊栖菜多酚溶液100 μL，样品质量浓度分别是：0.01、0.025、0.05、0.10、0.20 mg·mL^-1。孵育24 h后，每孔再分别加入10 μL 5 mg·mL^-1 MTT，继续孵育4 h后弃上清溶液，最后每孔加入100 μL DMSO，37 ℃充分振荡10 min，于570 nm处测定吸光度值，每组实验重复3次。以正常细胞为对照组，按照MTT法检测细胞存活率，考察羊栖菜多酚对HAEC细胞的影响。细胞存活率计算公式如下：

\mathrm{细胞}\mathrm{存活}\mathrm{率}(\mathrm{\%})=\frac{\mathrm{O}\mathrm{D}\mathrm{实验}\mathrm{组}}{\mathrm{O}\mathrm{D}\mathrm{空白}\mathrm{组}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}⑵

1.2.6　H₂O₂诱导HAEC细胞损伤模型的建立

在一定浓度下，以细胞生长抑制率50%左右为标准，细胞产生氧化损伤且在抗氧化物作用下能被修复作为细胞氧化损伤的建模条件^［21］。将HAEC细胞经复苏、培养、传代后，取处于稳定生长对数生长期的HAEC细胞以每孔100 μL（1×10⁵个/孔）加入96孔板中，放置5% CO₂、37 ℃培养箱孵育24 h。弃去上清液，正常对照组加入100 μL无血清DMEM培养基培养，实验组中分别加入由无血清DMEM培养基配制的H₂O₂质量浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol·L^-1各100 μL处理。孵育24 h后，每孔再分别加入10 μL 5 mg·mL^-1 MTT，继续孵育4 h后弃上清溶液，最后每孔加入100 μL DMSO，37 ℃充分振荡10 min，于570 nm处测定吸光度值。以正常细胞为对照组，按照MTT法检测细胞存活率，公式同⑵。以接近半数抑制的H₂O₂浓度作为氧化损伤浓度，完成以H₂O₂诱导的HAEC细胞氧化损伤模型的建模。

1.2.7　羊栖菜多酚对H₂O₂诱导的HAEC细胞损伤的保护作用

将HAEC细胞经复苏、培养、传代后，取处于稳定生长对数生长期的HAEC细胞以每孔100 μL（1×10⁵个/孔）加入96孔板中，放置5% CO₂、37 ℃培养箱孵育24 h。弃去上清液，分为空白组（加入100 μL无血清DMEM培养基）、模型组（加入100 μL 0.778 mmol·L^-1 H₂O₂）与实验组（加入由无血清DMEM培养基配制的质量浓度为0.010、0.025、0.50 mg·mL^-1各100 μL），孵育24 h后，每孔再分别加入10 μL 5 mg·mL^-1的MTT，继续孵育4 h后弃上清溶液，最后每孔加入100 μL DMSO，37 ℃充分振荡10 min，于570 nm处测定吸光度值，每组实验重复3次。按照MTT法检测细胞存活率，公式同⑵。考察羊栖菜多酚对H₂O₂诱导的HAEC细胞损伤的保护作用效果。

1.3　统计学处理

数据采用GraphPad Prism 9.0软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，采用单因素方差分析进行比较。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1　羊栖菜多酚体外抗氧化活性评价

羊栖菜多酚和维生素C对DPPH自由基的清除率变化趋势如图1所示。由图1可知，羊栖菜多酚和维生素C都有较强的DPPH自由基清除能力，经公式⑴计算得到羊栖菜多酚和维生素C的IC₅₀分别为0.074 mg·mL^-1、0.063 mg·mL^-1，当羊栖菜多酚浓度为0.15 mg·mL^-1时，其对DPPH自由基清除率为（79.97±1.09）%，约为同质量浓度维生素C的85.31%。实验结果表明，羊栖菜多酚具有较好的DPPH自由基清除能力。

羊栖菜多酚和维生素C对O₂⁻自由基的清除能力如图2所示。由公式⑴计算得知，羊栖菜多酚和维生素C的IC₅₀分别为0.069 mg·mL^-1、0.035 mg·mL^-1。当羊栖菜多酚浓度为0.15 mg·mL^-1时，其对O₂^-自由基清除率为（73.65±1.39）%，为阳性对照维生素C清除率的76.86%。实验结果表明，羊栖菜多酚对O₂^-自由基有一定的清除能力。

羊栖菜多酚和维生素C对ABTS⁺自由基清除率如图3所示。由公式⑴计算可知，羊栖菜多酚和维生素C的IC₅₀分别为0.089 mg·mL^-1、0.060 mg·mL^-1。当维生素C浓度大于0.12 mg·mL^-1时其对ABTS⁺自由基清除率逐渐达到平稳状态，而羊栖菜多酚浓度为0.15 mg·mL^-1时，ABTS⁺自由基清除率为（78.64±2.01）%，表明羊栖菜多酚对ABTS⁺自由基有一定的清除能力。

2.2　羊栖菜多酚对HAEC的细胞毒性

当细胞存活率低于90%时可以确认羊栖菜多酚对细胞存在毒性作用。采用MTT法检测羊栖菜多酚对HAEC的细胞毒性，由图4可知，羊栖菜多酚浓度为0.01、0.025、0.05、0.1、0.2 mg·mL^-1作用HAEC细胞8 h后，HAEC细胞存活率分别为（101.12±2.11）%、（99.73±1.97）%、（91.26±2.03）%、（72.48±2.57）%、（48.62±1.36）%。与空白对照组［（100±1.38）%］相比，羊栖菜多酚浓度在0.1、0.2 mg·mL^-1时，HAEC细胞活性受到明显抑制（P＜0.05）。当羊栖菜多酚浓度为0.01、0.025、0.05 mg·mL^-1时，HAEC细胞存活率大于90%，说明在该浓度条件羊栖菜多酚对HAEC细胞无明显毒性作用。因此，选择羊栖菜多酚0.01、0.025、0.05 mg·mL^-1作为后续研究。

2.3　H₂O₂诱导HAEC细胞氧化损伤模型

通过MTT预实验选择H₂O₂浓度梯度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol·L^-1的H₂O₂作用HAEC细胞后，以细胞生长抑制率50%左右为评价标准，选择最佳的损伤浓度，建立H₂O₂诱导的HAEC细胞损伤模型。由图5可知，H₂O₂浓度梯度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol·L^-1时，细胞生长抑制率分别为（98.84±1.44）%、（89.78±2.13）%、（81.16±2.26）%、（46.23±2.97）%、（20.47±1.82）%，H₂O₂浓度在0.6、0.8、1.0 mmol·L^-1时的HAEC细胞存活率与空白对照组相比，差异均有统计学意义（P＜0.05），并呈量效关系。经公式⑴计算得到IC₅₀为0.778 mmol·L^-1时，为理想造模条件。后续研究选择浓度0.778 mmol·L^-1的H₂O₂作为最佳造模条件。

2.4　羊栖菜多酚对H₂O₂诱导HAEC细胞损伤的保护作用

羊栖菜多酚对H₂O₂诱导HAEC细胞损伤的保护作用结果如图6所示，与空白对照组（100±2.46）%相比，模型组细胞存活率为（50.76±1.92）%，表明HAEC细胞受H₂O₂损伤差异有统计学意义（P＜0.05）。随着羊栖菜多酚浓度的增加，其对HAEC细胞的保护作用不断增强，并呈剂量依赖关系，与模型组相比，经0.01、0.025、0.05 mg·mL^-1的羊栖菜多酚处理后，HAEC细胞存活率分别为（59.15±2.46）%、（63.32±2.51）%、（72.57±1.89）%（P＜0.05）。以上结果表明，羊栖菜多酚能减轻细胞氧化损伤，对H₂O₂诱导HAEC细胞损伤有一定的保护作用。

3 讨论

本研究以羊栖菜为原料，通过60%乙醇提取结合硅胶柱层析梯度洗脱工艺制备了羊栖菜多酚，并系统评价了羊栖菜多酚的体外抗氧化活性及对H₂O₂诱导的HAEC氧化损伤的保护作用。结果表明，羊栖菜多酚对DPPH自由基、O₂⁻自由基及ABTS⁺自由基的IC₅₀分别为0.074 mg·mL^-1，0.069 mg·mL^-1和0.089 mg·mL^-1，其中DPPH自由基清除率在0.15 mg·mL^-1时为（79.97±1.09）%，接近同浓度维生素C的85.31%，表明羊栖菜多酚具有显著的体外抗氧化能力；在H₂O₂诱导的氧化损伤模型中，0.05 mg·mL^-1羊栖菜多酚可使细胞存活率从模型组的（50.76±1.92）%提升至（72.57±1.89）%（P＜0.05），且保护作用呈剂量依赖性。当羊栖菜多酚浓度≤0.05 mg·mL^-1时，其对HAEC无明显细胞毒性。

本研究在H₂O₂诱导的HAEC模型中验证了羊栖菜多酚的保护作用，对O₂⁻自由基和ABTS⁺自由基的清除能力弱于维生素C可能是羊栖菜多酚对脂溶性自由基（如DPPH）具有更高亲和力，这与褐藻多酚的疏水性结构特征相符^［10］。相较于LEE H H等^［22］研究仅关注羊栖菜酚类含量与抗氧化活性的相关性，本研究优化了羊栖菜多酚的提取纯化工艺，通过60%乙醇浸提结合硅胶柱层析梯度洗脱，实现了多酚类物质的高效富集与纯化，为后续活性成分研究及产业化制备提供了可参考的工艺参数；同时，首次聚焦羊栖菜多酚对H₂O₂诱导的HAEC细胞氧化损伤的保护作用，明确其在该细胞模型中的剂量依赖性保护效果及安全浓度范围，为其在心血管相关功能性食品或辅助药物开发中的应用提供了更具针对性的实验依据。后续我们拟通过制备型HPLC分离鉴定羊栖菜多酚中关键活性单体并分析构效关系；并开展动物模型验证羊栖菜多酚对心血管疾病的干预效果，通过检测细胞内ROS水平及GSH/GSSG比值，探究羊栖菜多酚调节细胞内抗氧化酶（SOD和CAT）的机制。进一步解析羊栖菜多酚的分子机制及体内外活性相关性，并开发纳米递送系统以提高其生物利用度，为羊栖菜多酚作为功能性食品添加剂或辅助药物的开发提供更全面的科学依据。

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基金资助

漳州市食品产业技术研究院开放项目(ZSY2022105)

漳州市自然科学基金资助项目(ZZ2020J43)