赣州市2017—2024年水产品和水体中霍乱弧菌监测结果分析

Analysis of monitoring results of Vibrio cholerae in aquatic products and water bodies in Ganzhou from 2017 to 2024

摘要

目的 探究赣州市水产品和水体中霍乱弧菌的污染情况，分析其血清型和毒力基因，为本地区霍乱暴发和防控提供理论依据。 方法 2017—2024年每年的4—10月，随机抽取赣州市定点海鲜餐馆和超市的水产品，并定点采集章江水体。开展霍乱弧菌分离与鉴定，同时对阳性分离菌株进行血清型和毒力基因检测。 结果 2017—2024年，共采集6种样本类型，共1 919份。1 919份样本中共检出霍乱弧菌48份，总检出率为2.50%；其中水产品监测1 133份，检出率为3.35%（38/1 133），章江水体监测786份，检出率为1.27%（10/786）；其中5月检出率最高（4.90%，15/306），8月未检出，其余月份均有检出；蛙类、甲壳类、鱼类、双壳类的检出率依次为12.39%、5.73%、2.08%、0.67%，龟鳖类未检出。48株菌株中，O1群小川型29株，O1群稻叶型18株，O139群1株，未发现彦岛型菌株。所有菌株霍乱毒素基因ctxAB检测结果均为阴性。 结论 赣州市市售水产品与水域环境存在O1群和O139群霍乱弧菌污染。建议加大监测力度，及时了解霍乱弧菌的污染情况，尽早发现霍乱疫情源头并及时采取有效措施。

Abstract

Objective To investigate the contamination of Vibrio cholerae in aquatic products and water bodies in Ganzhou， analyze their serum groups and virulence genes， and provide scientific significance for cholera outbreak prevention and control in the region. Methods In April to October of each year from 2017 to 2024， we randomly selected seafood products from designated seafood restaurants and supermarkets in Ganzhou， and collected water samples from the Zhangjiang River at designated locations. Isolation and identification of Vibrio cholerae were carried out， and serum group and virulence gene testing on positive isolated strains were conducted. Results From 2017 to 2024， a total of 1 919 specimens of 6 types were collected. Out of 1 919 specimens， 48 were found to contain Vibrio cholerae， with a total detection rate of 2.50%； among them， 1 133 aquatic products were monitored with a detection rate of 3.35% （38/1 133）， and 786 Zhangjiang water bodies were monitored with a detection rate of 1.27% （10/786）； the detection rate was highest in May （4.90%， 15/306）， none was detected in August， and Vibrio cholerae was detected in all other months. The detection rates of frogs， crustaceans， fish， and bivalves were 12.39%， 5.73%， 2.08%， and 0.67%， respectively， while turtles and turtles were not detected with Vibrio cholerae. Among the 48 strains identified， 29 strains were classified as O1 Ogawa type， 18 strains were classified as O1 rice leaf type，1 strain was classified as O139 type， no Hikishima type strain was found. All strains tested were negative for the choler toxin gene ctxAB. Conclusion There is contamination of O1 and O139 Vibrio cholerae in the aquatic products sold in Ganzhou and in the water environment. Therefore， it is recommended to increase monitoring efforts， keep abreast of the pollution situation of Vibrio cholerae， detect the source of cholera epidemic as early as possible， and take effective measures timely.

关键词

水产品和水体 / 霍乱弧菌O1和O139 / 监测结果分析

Key words

Aquatic products and water bodies / O1 and O139 Vibrio cholerae / Analysis of monitoring results

霍乱是由霍乱弧菌引起的烈性肠道传染病^［1］.在已发现200多个霍乱弧菌血清群中，O1群和O139群是引起霍乱暴发和流行的主要血清型^［2］。霍乱弧菌属于河口水体的自然菌群，当产毒霍乱弧菌在自然水体中大量增殖，借助水和食物（如污染的海、水产品）进入人群，则会导致疾病的发生和流行^［3］。自1817年第一次霍乱大流行以来，全球共记录了7起霍乱大流行^［4］。世界卫生组织认为目前仍处于第七次全球大流行中，迄今仍未停息，历时最长^［3］。2023年，103个国家向世界卫生组织报告了霍乱数据，其中45个国家报告了535 321例病例和4 007例死亡^［5］。赣州市虽处于江西最南边，但水域众多，全年气温较高，又临近沿海省份广东和福建，交通便利，贸易繁多，存在潜在的霍乱传播风险。因此，开展本地区水产品和水域环境中霍乱弧菌监测工作，有利于掌握赣州市市售水产品和水域环境霍乱弧菌的污染状况，便于对有污染监测点采取相应的防控措施，预防霍乱疫情发生。现就赣州市2017—2024年水产品和水体中霍乱弧菌（O1/O139群）的监测结果分析如下。

1 材料与方法

1.1　样本来源

根据《江西省霍乱监测方案》^［6］，2017—2024年每年的4—10月，对赣州市市售水产品及章江水体进行采样。每年选取赣州市1～2家定点海鲜餐馆和人流量较大的1～2家定点超市作为水产品抽样点，水产品每次抽样量至少20份，全年抽样量不少于140份，样本类型包括鱼类、双壳类、甲壳类、龟鳖类、蛙类水产品。定点采集赣州市章江水体，水体每次采样量至少14份，全年采样量不少于98份。样本严格按照无菌操作，4 ℃运送回实验室。

1.2　样本检测

1.2.1　试剂

碱性蛋白胨水和庆大霉素琼脂（北京陆桥）、营养琼脂（青岛海博）；霍乱弧菌O1群诊断血清、小川型诊断血清、稻叶型诊断血清和O139群诊断血清（郑州万泰）；霍乱弧菌（O1和O139）双重核酸检测试剂和霍乱弧菌ctxAB核酸检测试剂（深圳生科原）。以上试剂均在有效期内。

1.2.2　检测方法

根据《霍乱防治手册》（第六版）^［3］检测方法，称取25 g水产品样本（鱼类取肠内容物和鳃、双壳类取壳内软组织和壳内液体、蛙类取肠内容物、甲壳类取头部组织）剪碎或肛拭子样本（龟鳖类取全身涂抹样和肛拭子），加入225 mL碱性蛋白胨水中，充分混匀，置于37 ℃增菌培养8 h，进行二次增菌和划庆大霉素琼脂平板，二次增菌液再次在37 ℃培养8 h，平板37 ℃培养过夜。用二次增菌液划庆大霉素琼脂平板，平板培养过夜。水体样本无菌操作采集450 mL水样，加入50 mL 10倍浓缩碱性蛋白胨水中充分混匀，置于37 ℃增菌培养8 h，进行二次增菌和划庆大霉素琼脂平板，增菌液再次在37℃培养8 h，平板37℃培养过夜。用二次增菌液划庆大霉素琼脂平板，平板培养过夜。

1.2.3　可疑菌落分离鉴定

在庆大霉素琼脂平板上，选取无色透明或中间略带灰色半透明可疑菌落进行玻片凝集试验。对O1+O139群混合诊断血清凝集且生理盐水不凝集的菌株，转种营养琼脂平板上进行纯培养，对于纯培养菌株，进一步进行O1群诊断血清和O139群诊断血清凝集试验，对于O1群凝集菌株，需用小川型诊断血清和稻叶型诊断血清进行凝集，最终确认血清学分型。

1.2.4　核酸检测

按照核酸检测试剂说明书将营养琼脂平板确认血清学分型1～2个单个菌落加入50 μL DNA提取液中，混匀，置于100 ℃金属浴15 min，高速离心，取5 μL上清液，加入配好的20 μL体系中，按照说明书要求进行50 ℃ 2 min一个循环，95 ℃ 3 min一个循环，95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s 40个循环，进行实时荧光聚合酶链式反应。

1.3　统计学处理

采用SPSS 21.0软件进行数据分析，计数资料以n（%）表示，率的比较运用χ²检验或Fisher确切概率法。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1　总体情况

2017—2024年每年的4—10月，采集6种样本类型，分别为鱼类、双壳类、甲壳类、龟鳖类、蛙类水产品和章江水体，共1 919份样本，检出霍乱弧菌48份，总检出率为2.50%。水产品监测1 133份，检出霍乱弧菌38份，检出率为3.35%。水体监测786份，检出霍乱弧菌10份，检出率为1.27%，水产品和水体检出率比较，差异有统计学意义（χ²=8.246，P＜0.05）。2017年检出率与各年份检出率分别进行两两比较，P均＜0.05，差异有统计学意义。各年份中均检出霍乱弧菌，其中2017年检出率最高（8.82%，21/238），其次为2020年（2.52%，6/238），2021年和2022年检出霍乱弧菌最低，均为（0.84%，2/238）。不同年份霍乱弧菌检出率比较，差异有统计学意义（χ²=31.717，P＜0.05）。见表1。

2.2　不同月份霍乱弧菌监测情况

不同月份霍乱弧菌检出率比较，差异有统计学意义（χ²=23.894，P＜0.05）。5月份检出率与各月份检出率分别进行两两比较，P均＞0.05，差异无统计学意义。其中5月的检出率最高（4.90%，15/306），8月未检出。见表2。

2.3　不同类型样本霍乱弧菌检测情况

蛙类、甲壳类、鱼类、双壳类的检出率依次为12.39%、5.73%、2.08%、0.67%，龟鳖类未检出。各类水产品检出率比较，差异有统计学意义（χ²=38.315，P＜0.05）。章江水体检出率1.27%（10/786）。见表3。

2.4　霍乱弧菌的血清型和毒力基因情况

48株霍乱弧菌中，O1群霍乱弧菌占97.92%（47/48），O139群占2.08%（1/48）。O1群血清型中小川型占61.70%（29/47），稻叶型占38.30%（18/47），未检出彦岛型。小川型在甲壳类、蛙类、鱼类、双壳类和章江水体中均有检出，检出率分别为5.38%、1.77%、1.67%、0.22%、0.89%；稻叶型在蛙类、双壳类、鱼类和甲壳类中均有检出，检出率分别为10.62%、0.44%、0.42%、0.36%；O139群血清型只在章江水体中有检出，检出率为0.13%，见表3。所有菌株均未检出霍乱毒素毒力基因ctxAB。

3 讨论

本研究结果显示，赣州市2017—2024年监测水产品和水体样本共1 919份，检出霍乱弧菌48份，总检出率为2.50%。高于2020—2022年广州市海珠区总检出率0.00%^［7］和2012—2021年漳州市云霄县总检出率1.04%^［8］。提示赣州市水产品和水体中霍乱弧菌污染较严重，检出率高于沿海城市。这可能是因为内陆以淡水养殖为主，沿海地区以海水养殖为主，沿海城市养殖水盐度含量更高，不适合霍乱弧菌生长，导致检出率更低。赣州河流较多，要谨防水产品和水体中霍乱弧菌导致霍乱疫情。本研究结果显示，2017年检出最高，2020年其次，之后保持在一个低检出率。因2017年监管力度不够，混合售卖现象普遍，交叉污染严重，2020年后，监管力度增加，品种分开售卖。由于实验限制，并未对48株霍乱弧菌进行同源性检测，无法验证是否交叉污染导致此现象。此外，检出率降低也可能与卫生部门监管和宣教以及居民卫生意识提升等因素有关^［9］。另外，结果显示，8月检出率为零，而5月最高（4.90%），赣州属于亚热带季风气候，8月赣州全年温度最高，水温更高，5月温度较凉爽，水温更适宜霍乱弧菌生长繁殖。

与自然江河水体相比，水产品检出率更高，与厦门市思明区^［10］、漳州龙海区^［11］等研究结果一致。结果表明，不同地域的霍乱弧菌分布无差异，霍乱弧菌生活在水域环境，定殖于水产品体内和体表，现在市售水产品大多为养殖，水产品检出率比自然江河水体高，也是符合自然规律。与其他种类水产品相比，蛙类检出率显著更高，与贵州^［12］、厦门^［13］等地报道一致。可能是蛙类更容易携带霍乱弧菌^［9］，蛙类养殖池投放饵料多，水体长期富营养化，适合弧菌生存，容易导致外源性霍乱弧菌进入蛙池后在养殖水中生长繁殖，并在蛙和池水间形成循环^［14］，这提示在未来工作中应该加强对蛙类监测。龟鳖类未检出，与陈文怡^［15］研究不同。这可能是因为采样量较少和采样只取了涂抹样和肛拭子所致。龟鳖类有坚硬外壳保护，皮肤和肌肉组织韧性高，普通工具难以切开，而未取肠内容物，以致未检出。以后工作中，应加大抽样量，取龟鳖类肠内容物检测。

霍乱弧菌致病性主要与霍乱肠毒素有关^［16］。霍乱肠毒素是霍乱弧菌最重要的致病因子，其编码基因为ctxAB，是目前已知的致泄毒素中最强烈毒素^［17］。产毒型霍乱弧菌定殖于小肠黏膜上皮细胞。通过产生霍乱毒素导致人体产生严重腹泻、电解质平衡失调、代谢酸中毒等系列临床症状^［18］。本研究中48株霍乱弧菌的ctxAB基因均未检出。与王伟杰等^［19］研究一致。近几年，国内有多起由非产毒株霍乱弧菌引发的腹泻疫情报道^［20-21］。有研究^［22］指出，在适宜的环境条件下，非产毒的菌株能够通过基因传递机制转化为产毒的菌株。赣州市霍乱弧菌虽然不携带ctxAB基因，但有研究^［23］表明霍乱弧菌携带其他毒力基因也可导致腹泻。因此，以后应加强其他毒力基因检测，增强对霍乱弧菌的监测力度和制定霍乱防治策略，力求在疾病暴发初期准确识别并予以确认，并采取有效措施进行管控。

综上所述，赣州市水产品和水体存在O1群和O139群霍乱弧菌的污染，特别是O1群，因此应加大监测力度，以预防霍乱疫情发生。本研究也存在不足之处，仅对O1群和O139霍乱弧菌的检测结果进行分析，未开展菌株药物敏感性和同源性分析，尚无法对菌群的耐药性及区域内传播风险评估进行深入研究，以形成针对性的防控策略。

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基金资助

2023年赣州市指导性科技计划项目(GZ2023ZSF342)