E3泛素连接酶与炎症性肠病及结直肠癌的因果关联：一项孟德尔随机化研究

Causal association of E3 ubiquitin ligases with inflammatory bowel disease and colorectal cancer： a Mendel randomized study

摘要

目的 探讨E3泛素连接酶（E3 ubiquitin ligases，E3s）与炎症性肠病（Inflammatory bowel disease，IBD）及结直肠癌（Colorectal cancer，CRC）的因果关系。 方法 通过双向孟德尔随机化（Mendelian randomization，MR）和贝叶斯加权孟德尔随机化（Bayesian weighted mendelian randomization，BWMR）分析，研究25种E3s与IBD/CRC的因果关系。MR分析采用逆方差加权、MR-Egger回归、加权中位数、简单模式及加权模式等多种方法进行综合评估，并辅以异质性检验、水平多效性检验（MR-PRESSO和MR-Egger）和留一法分析等敏感性分析，以确保结果的稳健性。 结果 RNF13、RNF128和ZNRF3与IBD风险呈正相关（OR=1.079，P=0.001； OR=1.075，P=0.023；OR=1.113，P=0.019）。其中，RNF13与溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis，UC）风险呈边缘显著正相关（OR=1.072， P=0.046）。ZNRF3与克罗恩病（Crohn's disease，CD）风险呈正相关（OR=1.291，P=0.005）。RNF8与CRC风险呈负相关（OR=0.906，P＜0.001）。RNF34与CRC风险增加呈正相关（OR=1.081，P=0.016）。 结论 RNF13、RNF128和ZNRF3是IBD的因果风险因子（其中RNF13与UC相关，ZNRF3与CD显著相关）；RNF8是CRC的潜在保护因子，而RNF34是其风险因子。

Abstract

Objective Exploring the causal relationship between E3 ubiquitin ligases （E3s） and Inflammatory bowel disease （IBD） and Colorectal cancer （CRC）. Methods The causal relationship between 25 E3s and IBD/CRC was studied through bidirectional Mendelian randomization （MR） and Bayesian weighted mendelian randomization （BWMR）. The MR analysis was comprehensively evaluated using inverse variance weighting， MR-Egger regression， weighted median， simple mode and weighted mode， and was supplemented by sensitivity analysis such as heterogeneity test， horizontal pleiotropic test （MR-PRESSO and MR-Egger） and retention-one-based analysis to ensure the robustness of the results. Results RNF13， RNF128 and ZNRF3 showed positive associations with IBD risk （OR=1.079， P=0.001； OR=1.075， P=0.023； OR=1.113， P=0.019）. Notably， RNF13 demonstrated a marginally significant positive association with UC risk （OR=1.072， P=0.046）， while ZNRF3 was significantly associated with increased CD risk （OR=1.291， P=0.005）. For CRC， RNF8 exhibited a negative association （OR=0.906， P＜0.001）， whereas RNF34 showed a positive association with increased risk （OR=1.081， P=0.016）. Conclusion The findings demonstrate causal relationships between RNF13，RNF128，ZNRF3 and IBD development （with RNF13 specifically associated with UC and ZNRF3 showing significant association with CD）. Additionally， RNF8 was identified as a protective factor against CRC， while RNF34 was found to promote CRC risk.

Graphical abstract

关键词

E3泛素连接酶 / 结直肠癌 / 炎症性肠病 / 孟德尔随机化

Key words

E3 ubiquitin ligases / Colorectal cancer / Inflammatory bowel disease / Mendelian randomization

目前，结直肠癌（Colorectal cancer，CRC）作为一种恶性肿瘤，在发病率和死亡率方面分别位居世界第三和第二^［1］。CRC的发生和发展与疾病状态、遗传因素、饮食、生活方式和肠道菌群有关^［2-3］。炎症性肠病（Inflammatory bowel disease，IBD）是CRC的重要危险因素^［4］。IBD是一种以肠道慢性炎症和反复发作为特征的常见消化系统疾病，已成为发病率逐年增加的全球性疾病，现全球诊断人数超700万人^［5-6］。IBD主要有2种类型：溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis，UC）和克罗恩病（Crohn's disease，CD）。长期的炎症过程会导致结肠黏膜异常增生，增加结直肠癌的风险。泛素在IBD和CRC的发展中起着重要作用，如E3泛素连接酶（E3 ubiquitin ligases，E3s）RNF128通过泛素化降解IL-6受体，抑制IBD和CRC的进展^［7］。其调节作用主要依赖于泛素连接酶修饰的底物蛋白活性的改变或泛素蛋白酶体的降解。

E3泛素连接酶是体内蛋白质泛素化降解的关键酶，决定泛素化系统的底物特异性^［8］。它通过泛素化修饰调节细胞中蛋白质的数量和活性，从而维持细胞稳态^［9］。E3s能够特异性识别底物蛋白，参与调控多种信号通路。其功能异常与IBD、CRC等疾病的发生密切相关，因此被视为潜在的药物靶点^［10］。但E3s与IBD/CRC是否存在因果关联尚不清楚。

孟德尔随机化（Mendelian randomization，MR）分析是一种利用与暴露因素强相关的单核苷酸多态性（Single-nucleotide polymorphisms，SNPs）作为工具变量（Instrumental variables，IVs）来估计与目标结局之间因果关系的方法^［11］。本研究旨在通过MR分析全基因组关联研究（Genome-wide association study，GWAS）数据，探讨E3s与IBD/CRC的因果关系。

1　材料与方法

1.1　研究设计

本研究使用双向MR方法，研究暴露因素（25种E3s）与结局（IBD/CRC）之间的因果关系。MR分析必须满足3个假设：⑴作为遗传变异的工具变量（IVs）与暴露因素强相关；⑵工具变量与潜在的混杂因素无关；⑶工具变量只能通过暴露因素影响结局^［12］。本研究中MR分析流程如图1所示。

1.2　数据来源

本研究使用的GWAS数据分别来自INTERVAL（https：//ega-archive.org/）和FinnGen（https：//www.finngen.fi/en），所有参与者均为欧洲人群。所有原始研究的参与者均知情同意。

1.2.1　暴露数据

本研究使用的E3s数据来源于INTERVAL项目^［13］。该研究对约3 300例英国欧洲裔个体的约3 000种血浆蛋白进行了蛋白质组学测定并提供了相应的遗传数据。本研究共纳入25种E3s蛋白水平作为暴露因素，见表1。

1.2.2　结局数据

从最新的FinnGen R11研究中获得了IBD及其亚型（UC和CD）以及CRC的GWAS数据。具体为：IBD（443 974例对照和9 759例病例）、UC（446 419例对照和6 435例病例）、CD（451 337例对照和2 186例病例）和CRC（345 118例对照和8 801例病例）（数据截至2024年9月20日）^［14］。本研究的结局数据见表2。

1.3　工具变量（IVs）的选择

MR分析的潜在IVs条件：全基因组范围内与各个E3s显著相关的SNPs（若全基因组显著水平P＜5×10^-8的SNPs数量小于3，则调整为P＜5×10^-6进行筛选），排除连锁不平衡（聚类距离=10 000 kb和r² =0.001）的相关SNPs^［15］。使用公式F=β²/SE²计算每个IV的F值，F＞10表示不存在弱工具变量偏差^［16］。反向MR分析中采用相同标准，并选择与IBD/CRC相关的SNPs作为IVs。

1.4　MR分析和BWMR验证

为了确保MR分析结果更加可靠，使用了5种方法来评估暴露因素与结局之间的因果关系，包括逆方差加权（Inverse variance weighted，IVW）、MR-Egger回归、加权中位数（Weighted median，WM）、简单模式和加权模式方法，并辅以异质性检验、水平多效性检验（MR-PRESSO和MR-Egger）和留一法分析等敏感性分析。IVW方法用作评估MR分析中因果效应的主要方法，MR-Egger和加权中位数等方法用于评估多效性对结果的潜在影响^［17-19］。

异质性检验（Cochran's Q）统计量用于评估所选SNPs的异质性，P＞0.05表示没有异质性^［20］。进行敏感性分析以检测结果的一致性并纠正可能存在的水平多效性^［19］。作为敏感性分析之一，MR-Egger方法可以通过嵌入的截距检验（P＜0.05）检测潜在的水平多效性，并对水平多效性进行校正后给出估计值^［21］。MR-PRESSO可以识别和去除异常SNPs以生成新的估计值^［22］。

BWMR方法可以有效揭示暴露因素与结局之间的因果关系，同时基于GWAS汇总统计量的标准误差和P值，评估由弱效应和弱水平多效性引起的不确定性影响^［23］。因此，我们采用BWMR进一步验证MR分析结果中IVW方法的可靠性（P＜0.05）。

1.5　统计学处理

通过R语言（版本4.3.3）、MendelianRandomization包（版本0.10.0）和TwoSampleMR包（版本0.6.3）进行统计分析和MR分析。计算OR值及95%CI。检验水准α=0.05。

2　结果

2.1　IVs选择

根据既定的质量控制标准，选择与E3s相关的SNPs作为IVs。当SNPs的F统计量大于10时，表示它们在MR分析中强相关E3s。

2.2　MR分析结果

共测试了25种E3s与2种结局疾病（IBD及其亚型CD、UC，以及CRC）之间的因果关系，暴露数据见表1，结局数据见表2。IVW分析显示：RNF13、RNF128和ZNRF3与IBD风险呈正相关（OR=1.079，P=0.001；OR=1.075，P=0.023；OR=1.113，P=0.019）。其中，RNF13与UC风险呈边缘显著正相关（OR=1.072，P=0.046）。ZNRF3与CD风险呈正相关（OR=1.291，P=0.005）。RNF8与CRC风险呈负相关（OR=0.906，P＜0.001）。RNF34与CRC风险增加呈正相关（OR=1.081，P=0.016）。MR-Egger和加权中位数结果与IVW分析结果方向一致。未观察到其他E3s与结局之间存在显著关联，见表3。

2.3　BWMR分析

BWMR在弱工具存在时表现更稳健，估计偏差更小。采用BWMR分析验证MR结果，以下因果关系仍然显著：RNF128与IBD；RNF8和RNF34与CRC；RNF13与UC、IBD；ZNRF3与IBD、CD（表4）。上述结果与IVW分析结果的效应方向和效应量一致。

2.4　敏感性分析

根据Cochran's Q检验，MR分析结果未发现异质性的证据（P＞0.05）。MR-PRESSO分析和MR-Egger回归结果显示不存在显著的水平多效性（表5）。工具变量的因果效应估计值均符合线性趋势（图2），进一步支持IVW结果的稳健性。此外，漏斗图分析和留一法检验均未提示水平多效性或异常工具变量的存在（图3、图4）。上述结果表明MR分析相对稳定。

2.5　反向MR分析

为进一步验证因果方向并排除反向偏倚，本研究选择与IBD或CRC相关的SNPs作为IVs进行了反向MR分析，检验IBD或CRC对E3s的潜在因果效应。反向MR分析中未发现疾病对E3s有显著因果效应（IVW P＞0.05），支持E3s对疾病具有因果影响的推断，而非疾病对E3s的反向影响。

综上所述，本研究通过双向MR分析了25种E3s与IBD/CRC之间的因果关系。结果表明，RNF13、RNF128和ZNRF3对IBD具有正向因果关系。RNF34对CRC具有正向因果关系。RNF8与CRC呈负相关。这些E3s可能在肠道疾病的发展中发挥关键作用。

3　讨论

本研究利用GWAS汇总数据，通过MR分析探讨E3s与IBD/CRC之间的因果关系。敏感性分析和BWMR分析验证了MR结果，发现RNF8通过降低CRC风险（OR=0.906）可能发挥保护作用，而RNF34增加CRC风险（OR=1.081）。ZNRF3、RNF13和RNF128与IBD风险增加相关（OR值分别为1.113、1.079和1.075）。但目前关于E3s与IBD/CRC之间关系的研究还比较有限。

RNF8属于环指类E3泛素连接酶家族，是DNA双链断裂信号转导的关键因子^［24］。当DNA受损时，RNF8参与组蛋白H2A和H2B的单泛素化修饰，促进DNA损伤信号的传递，对于DNA损伤修复、细胞周期检查点激活以及维持基因组稳定性至关重要^［25］。RNF8是保护端粒末端完整性和调节细胞周期过程的重要因子，对肿瘤的发生具有双重作用。尽管本研究未发现RNF8与CRC的显著关联，但既往研究表明，RNF8与结肠癌组织中的c-Myc蛋白表达呈正相关，RNF8敲低可以显著抑制结肠癌细胞的生长，RNF8通过β-catenin介导的c-Myc表达上调和K63多泛素化促进其核易位，从而促进CRC细胞的增殖^［26］。这与本研究结果不一致，这种差异可能源于：①RNF8的致癌功能具有表达阈值效应和微环境依赖性，其遗传决定的基线表达量不足以驱动肿瘤发生；②肿瘤进展中获得的表观遗传激活（如启动子低甲基化）放大了RNF8的病理作用；③存在未被MR模型捕获的代偿性调控网络。有研究^［27］表明，RNF8介导AKT1的泛素化，从而抑制AKT/mTOR信号通路，促进自噬，在UC中发挥保护作用。在本研究中，RNF8与UC之间未发现显著的因果关系，这种差异可能与以下原因有关：①RNF8的保护作用可能在病理状态下才被显著激活；②体内可能存在其他E3泛素连接酶的代偿机制，缓冲了其遗传变异的影响。因此，RNF8更可能是一个有潜力的治疗靶点，而非主要的遗传风险因素。

目前关于RNF13在疾病中的研究报道有限，其表达在癌症进展和转移中的具体作用尚不清楚。RNF13的缺失降低了肿瘤肺组织中GM-CSF的浓度，有利于细胞转移侵袭，导致Rnf13^-/-小鼠的癌细胞转移能力增强^［28］。RNF13影响受损区域多种细胞因子的浓度，并通过影响IL-4/IL-6功能调节肌肉生成^［29］。RNF13在CRC和IBD中的作用尚未报道。Circ_RNF13通过TRIM24介导DDX27的表达，并通过抑制FBXW7介导的降解来稳定TRIM24，从而调节CRC的干细胞特性和化学敏感性^［30］。本研究结果表明，RNF13对IBD及其亚型CD具有促进作用。

RNF128能够介导靶蛋白的泛素化和降解，也是重要的免疫调节分子。RNF128在IBD和CRC发生发展中的作用仍存在争议。据报道，RNF128的高表达与IBD患者的病情进展呈负相关^［31-32］。在CRC中，RNF128通过下调Wnt/β-catenin信号通路抑制CRC细胞的增殖、迁移和侵袭^［33］。相反，CRC组织中RNF128 mRNA和蛋白的表达水平显著高于邻近组织。RNF128通过介导PI3K/AKT信号通路促进CRC细胞的恶性发展^［34］。RNF128特异性促进K48相关的多泛素化和IL-6受体IL-6Rα和gp130的降解，下调IL-6/STAT3信号通路，以减轻结肠炎的严重程度和CRC的发展^［7］。本研究显示，RNF128与IBD之间存在正向因果关系，表明RNF128的表达对IBD具有促进作用，这种矛盾主要源于研究设计与因果方向的根本差异：本研究采用孟德尔随机化分析，旨在推断终生遗传倾向的因果效应，即探究基础RNF128水平对疾病发病的长期影响；而既往多数实验研究检测的是疾病已发生状态下RNF128的表达变化，这种变化更可能是疾病进程所导致的结果或机体的一种代偿性适应，而非初始原因。此外，人群差异也可能带来影响：本研究基于欧洲人群遗传数据，而部分实验研究来自亚洲人群样本。更重要的是，RNF128功能具有双重性：在固有免疫中或通过抑制IL-6信号起保护作用，但在适应性免疫中，它通过诱导T细胞无法抑制免疫应答，反而可能破坏黏膜稳态，增加疾病易感性。本研究结果揭示了RNF128在免疫调控中的复杂角色，其最终效应高度依赖于细胞环境、表达时机及病理阶段。

ＲNF34可泛素化Caspase-8和Caspase-10，引起这2种蛋白通过泛素蛋白酶体途径降解，从而抑制二者介导的细胞凋亡^［35］。同时也参与先天免疫反应，RNF34促进MAVS蛋白通过自噬途径降解，从而负调控RIG-I介导的先天免疫信号通路调节先天免疫反应^［36］。RNF34不仅指导PGC-1的蛋白酶体降解，还通过破坏NOD1受体的稳定性，影响肿瘤微环境^［36-37］。获得抗凋亡特性是癌变的重要步骤，与癌变的进一步恶性转化和不良预后相关，这表明RNF34的抗肿瘤和抗凋亡功能可能在肿瘤的发生发展中发挥重要作用^［38］。由于这些致癌特征，RNF34在结直肠癌发生中起着至关重要的作用，其过表达对细胞死亡信号通路产生负面影响^［39］。这些发现与本研究结果一致，进一步强调了E3泛素连接酶在肿瘤发生中的复杂调控作用。

ZNRF3参与Wnt等信号通路的泛素化，维持细胞稳态。通过泛素化Wnt受体，促进其降解，从而抑制Wnt/β-catenin信号通路的过度激活。在多种癌症中（如结直肠癌、肾上腺皮质癌），ZNRF3的突变或缺失导致Wnt受体积累，引发β-catenin信号异常激活，参与肿瘤发生^［40］。ZNRF3缺失或突变还可导致EGFR信号通路的过度激活，从而促进肿瘤生长^［41］。ZNRF3的降解受SCFβ-TrCP泛素连接酶复合物调控，而CK1激酶介导的磷酸化是这一过程的前提。此外，酪氨酸磷酸化（如MET激酶介导的4Y基序磷酸化）可抑制ZNRF3的内吞信号，增强Wnt活性^［42］。这些机制表明，ZNRF3在Wnt信号通路的调控中具有精细的时空特异性，其功能异常可能与IBD和CRC的发生密切相关。

本研究的优势为方法学的严谨性和创新性：⑴本研究基于GWAS数据，采用双向MR分析，有效避免了传统观察性研究中常见的混杂因素和反向因果关系干扰；⑵通过整合多种敏感性分析方法（包括MR-Egger、MR-PRESSO和BWMR），确保因果推断结果的稳健性；⑶与传统单向MR分析相比，双向MR设计能够更全面地评估暴露与结局之间的潜在相互作用，使研究结论更加可靠。然而，也存在一些局限性：⑴所有GWAS数据均来自欧洲人群，这限制了研究结论在其他种族群体中的普适性，未来需要在亚洲、非洲等多民族人群中进行验证；⑵虽然MR分析提供了统计学上的因果证据，但E3s影响IBD/CRC的具体分子机制仍需通过实验研究进一步阐明。

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基金资助

江西省教育厅科技重点项目(GJJ2401319)

江西省自然科学基金重点项目(20242BAB26091)