PTA表达盒的构建及其对本氏烟草SGS3基因的干扰研究

摘要

RNA干扰作为植物抗病毒免疫的核心机制，其调控网络中SGS3(suppressor of gene silencing)基因在RDR6介导的双链RNA合成过程中扮演关键角色。为深入探究SGS3基因功能，对本氏烟草SGS3基因引入新型多靶点基因沉默系统——PTA(poly-tRNA-amiRNA)技术，并与传统单个amiRNA进行RNAi效率的系统性比较。首先针对SGS3基因的锌指（ZF）、XS和卷曲螺旋（coiled coil,CC）等三个结构域各设计合成一个特异性amiRNA，通过分子克隆技术构建pBI121-SGS3-amiRNA1/2/3重组表达载体。利用农杆菌介导的瞬时表达系统，对三个重组载体进行功能验证，结果显示amiRNA2对SGS3基因的沉默效率显著高于其他两个靶点。基于此，采用Golden Gate克隆技术，将上述三个amiRNA与三个tRNA串联组装，成功构建PTA-SGS3表达盒，并整合至pBI121植物表达载体。通过与携带绿色荧光蛋白标记的大豆花叶病毒侵染性克隆SMV-GFP共侵染本氏烟草，系统检测PTA系统的RNAi效率及抗病毒活性。RTqPCR分析表明，相较于单一amiRNA,PTA系统可使SGS3基因沉默效率提升44.8%，显著增强靶基因沉默效果。通过GFP荧光强度定量分析及DAB组织化学染色实验，发现经PTA表达盒侵染的本氏烟草中，SMV病毒积累量较单amiRNA处理组增加50.6%。

关键词

本氏烟草 / RNA干扰 / SGS3基因 / amiRNA / PTA表达盒