大豆花叶病毒山西半夏分离物全基因组序列分析

Analysis of the Complete Genome Sequence of Soybean Mosaic Virus Shanxi Pinellia ternata Isolate

摘要

大豆花叶病毒（SMV）在大豆生产中会造成产量和品质的严重下降，具有传播广泛和致病性强的特点，但宿主范围相对较窄，以豆科植物为主。近年来研究却表明，SMV能够跨科侵染天南星科植物半夏（Pinellia ternata）。为明确侵染山西半夏的大豆花叶病毒分离物（SMV-SXBX）的基因组特征，采用生物信息学软件对侵染山西半夏的SMV-SXBX进行了序列相似性分析、系统进化分析、氨基酸功能位点分析和重组分析。序列相似性分析结果表明，SMV-SXBX与SMV-Hangzhou分离物（GenBank登录号：AJ507388.2）的相似性最高，核苷酸序列相似性为92.09%，氨基酸序列相似性为95.91%；系统进化分析结果显示，SMV-SXBX与SMV-Hangzhou分离物聚为一簇，亲缘关系最近。在SMV-SXBX基因组中，P1蛋白的序列差异性最大，核苷酸和氨基酸序列差异性分别为34.93%和36.28%。突变与氨基酸功能分析结果表明，SMV-SXBX氨基酸序列中存在多个氨基酸突变位点；重组分析结果表明，SMV-SXBX在3 056—6 895 bp处有重组事件的发生，主要亲本为SMV-HZ1分离物（GenBank登录号：AJ628750.1），次要亲本为SMV-XFQ008分离物（GenBank登录号：KP710873.1）。综上研究结果，明确了SMV-SXBX的基因组特征，其发生的氨基酸突变及基因重组可能是导致大豆花叶病毒跨科侵染半夏的原因之一。

Abstract

Soybean mosaic virus(SMV) can cause a serious decline in yield and quality in soybean production. It has the characteristics of wide spread and strong pathogenicity, but the host range is relatively narrow, mainly legumes. In recent years, studies have shown that SMV can cross-family infect Pinellia ternata. In order to clarify the genomic characteristics of soybean mosaic virus isolate infecting P. ternata in Shanxi province(SMV-SXBX), in this study, bioinformatics software was used to analyze the sequence similarity, phylogenetic analysis, amino acid functional site analysis, and recombination analysis of SMV-SXBX. Sequence similarity analysis showed that SMV-SXBX had the highest similarity with SMV-Hangzhou isolate(GenBank accession number: AJ507388.2), and the nucleotide sequence similarity was 92.09 %, the amino acid sequence similarity was 95.91 %. Phylogenetic analysis also showed that SMV-SXBX and SMV-Hangzhou isolates were clustered together and had the closest genetic relationship. In the SMV-SXBX genome, the sequence difference of P1 protein was the largest, and the nucleotide and amino acid sequence differences were 34.93% and 36.28%, respectively. Mutation and amino acid function analysis showed that there were multiple amino acid mutation sites in the SMV-SXBX amino acid sequence. Recombination analysis showed that SMV-SXBX had a recombination event at 3 056-6 895 bp. The major parent was SMV-HZ1 isolate(GenBank accession number: AJ628750.1), and the minor parent was SMV-XFQ008 isolate(GenBank accession number: KP710873.1). In summary, the results clarified the genomic characteristics of SMV-SXBX, and the amino acid mutations and gene recombination may be the reason why SMV-SXBS can cross-family infect P. ternata.

Graphical abstract

关键词

大豆花叶病毒 / 半夏 / 全序列分析 / 系统进化分析 / 氨基酸功能位点分析 / 重组分析

Key words

soybean mosaic virus / Pinellia ternata / full sequence analysis / system evolution analysis / analysis of amino acid functional sites / recombination analysis

药材半夏为天南星科半夏属植物半夏（Pinellia ternata（Thunb.）Breit.）的干燥块茎，在我国各地均有分布，主产区位于我国长江领域的四川、湖南、河南、贵州、安徽等省^[1]。其属于耐阴不喜阳植物，在适度的遮光条件下生长茂盛，但光照过强时难以生存。半夏的生长对温度有极高的要求，温度过低或者过高都容易引发倒苗问题，在温度低于10 ℃时抑制生长，高于30 ℃时也会使其生长不良，最适生长温度为15~25 ℃。此外，半夏根系较浅，生长在海拔2 500 m以下的潮湿、温暖、隐蔽和疏松的砂壤土中，而且喜阴喜湿，土壤最适含水量为15%~30%，过旱易倒苗枯死，过湿易烂根生病^[2]。半夏既可以进行有性繁殖，也可以进行无性繁殖，其中，有性繁殖以种子为主，无性繁殖以块茎和珠芽为主^[3-4]。半夏作为一味大宗药材，具有广泛的临床应用价值，不仅可以治疗梅核气症、痰多咳喘、胸脘痞闷、呕吐反胃、痰厥头痛、风痰眩晕、痰饮眩悸等多种疾病，也应用在多种经典方剂中，如半夏厚朴汤、半夏泻心汤、桑白皮汤、越婢加半夏汤等^[5]。半夏的现代药理学研究表明，其含有的生物碱等多种活性成分，具有镇咳化痰、平喘、止呕、降压、降脂等作用^[6-7]。除此之外，根据不同的病情和症状，可通过特定的炮制方法或与其他药物搭配发挥独特疗效，具有很好的开发前景。

目前，随着市场需求及临床用药量的不断增长，野生半夏被无节制采挖，导致其生长环境逐渐恶化，大幅减产。为了满足市场对半夏的需求，开始进行大面积的无性繁殖，然而无性繁殖却导致了诸多问题的出现，比如病毒病、块茎腐烂病、疫病等病害^[8-9]，造成半夏品质退化^[10]，对其产量和品质影响较大。其中，病毒病害对半夏造成的损失最为严重，同时也最难防治。山西农业大学中药材旱作栽培与综合开发利用团队前期研究发现，侵染半夏的病毒病原有黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、芋花叶病毒（Dasheen mosaic virus，DsMV）、魔芋花叶病毒（Konjac mosaic virus，KoMV）、烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus，SMV）等，且已经克隆得到了侵染山西半夏SMV的全基因组序列^[11]。

SMV为马铃薯Y病毒科中的马铃薯Y病毒属（Potyvirus）成员，宿主范围相对较窄，主要以大豆、蚕豆、豌豆、四季豆等豆科植物为主^[12-14]。但中药材旱作栽培与综合开发利用团队前期研究发现，SMV还可以跨科侵染天南星科植物半夏^[11]和菊科植物白术^[15]，不过其实现跨科侵染的机制还不清楚。

本研究利用生物信息学手段对侵染山西半夏的大豆花叶病毒全基因组序列进行分析，以期能够发现与病毒致病性相关的关键基因或位点，为揭示SMV跨科侵染半夏的分子机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

山西半夏大豆花叶病毒分离物（SMV-SXBX）的核苷酸和氨基酸序列为山西农业大学中药材旱作栽培与综合开发利用课题组前期在山西调研过程中发现并分离、测序所得^[11]。106株SMV分离物的核苷酸及氨基酸序列来自美国国家生物信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）。

1.2 试验方法

1.2.1 SMV-SXBX分离物序列的相似性与差异性分析

利用生物信息学软件DNAMAN将SMV-SXBX序列与NCBI中的106条SMV分离物序列进行核苷酸和氨基酸序列同源性分析。

1.2.2 SMV-SXBX分离物序列系统进化分析

利用MEGA 7.0软件对SMV-SXBX序列与106条SMV分离物序列以最大似然值法（Maximum Likelihood，ML）进行系统进化分析，并构建系统进化树。

1.2.3 SMV-SXBX分离物突变与氨基酸功能分析

利用在线软件Network Protein Sequence（http://npsa-pbil.ibcp.fr）对SMV-SXBX氨基酸序列进行功能位点分析。

1.2.4 SMV-SXBX分离物基因重组分析

利用生物信息学软件RDP4中的RDP、GENENCONY、BootScan、MaxChi、Chimaera、SiScan和3SEQ共7种方法对包括SMV-SXBX在内的107株SMV分离物核苷酸序列进行重组分析。

2 结果与分析

2.1 SMV-SXBX基因组结构

SMV-SXBX基因组结构如图1所示^[11]，由9 735个核苷酸组成（登录号为MT712111），是典型的Potyvirus属成员，与其他报道的SMV一致，具有一个大的开放阅读框（ORF），编码一个由3 105个氨基酸组成的多蛋白，预测分子质量为354.7 ku。ORF从167 bp开始，在9 482—9 484 bp位置以终止密码子结束，共编码11个蛋白质，分别是P1、HC-Pro、P3、P3N-PIPO（位于P3阅读框内部）、6K1、CI、6K2、NIa-VPg、Nia-Pro、Nib、CP，各蛋白的预测切割位点分别为：IVQF₃₃₀/S（PI/HC-Pro）、YRVG₇₈₇/G（HC-Pro/P3）、VSVQ₁₁₃₄/V（P3/6K1）、VKVQ₁₁₈₆/S（6K1/CI）、VQLQ₁₈₂₀/S（CI/6K2）、VTTQ₁₈₇₃/G（6K2/NIa-VPg）、VEVE₂₀₆₃/S（NIa-VPg/NIa-Pro）、VAVQ₂₃₀₆/S（NIa-Pro/NIb）和VSLQ₂₈₂₃/S（NIb/CP），5′和3′UTR分别由166、252 bp组成。

2.2 序列同源性分析

为了比较SMV-SXBX与其他已知SMV分离物的差异，将SMV-SXBX与其他106株已知SMV分离物的核苷酸和氨基酸序列进行同源性分析，结果如表1所示，核苷酸序列相似性为73.84%~92.09%，氨基酸序列相似性为79.27%~95.91%；其中，与SMV-SXBX序列相似性最高的是SMV-Hangzhou分离物（GenBank number：AJ507388.2），核苷酸序列相似性为92.09%，氨基酸序列相似性为95.91%。

从表2可以看出，包括SMV-SXBX在内的107条SMV序列的P1、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、NIa-VPg、NIa-Pro、NIb和CP蛋白的核苷酸序列差异分别为34.93%、4.56%、4.25%、3.71%、4.31%、3.79%、4.52%、3.71%、4.06%和9.63%，氨基酸序列差异分别为36.28%、2.17%、2.93%、1.62%、1.40%、0.79%、1.05%、0.59%、1.47%和6.94%，表明序列差异最大的蛋白为P1蛋白。

2.3 系统进化分析

为明确SMV-SXBX和其他SMV分离物之间的进化关系，以最大似然法自展值1 000（Bootstrap=1 000）构建核苷酸序列系统发育树，结果如图2所示，SMV-SXBX与SMV-Hangzhou分离物聚为一簇，亲缘关系最近，与相似性分析结果一致。

2.4 突变与氨基酸功能分析

包括SMV-SXBX在内的107株SMV分离物的氨基酸序列比对结果表明，P1、HC-Pro、CI、6K2、NIa-VPg和NIa-Pro中一些特定的氨基酸位点发生了变化，这些氨基酸位点的变化直接导致相应蛋白功能位点的变化（表3）。经Proscan检测发现，一些特定的氨基酸残基与相应功能有关，例如，HC-Pro蛋白中的K₁₂₆/T突变和CI蛋白中的P₄₈₅/S突变改变了相应蛋白的N-糖基化位点；P3蛋白中的A₁₈₂/T和CP蛋白中的S₁₈/N突变改变了cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点；6K2蛋白中的H₃/Y突变和NIa-VPg蛋白中的S₁₇₈/A突变改变了酪蛋白激酶II磷酸化位点；NIa-Pro蛋白的S₃₉/A和CP蛋白的S₂₅₆/A突变改变了相应蛋白的N-酰基化位点。

2.5 重组分析

采用RDP4软件中的RDP、GENENCONY、BootScan、MaxChi、Chimaera、SiScan和3SEQ共7种方法对包括SMV-SXBX在内的107株SMV分离物核苷酸序列进行重组分析，结果如图3所示，7种方法均检测到在SMV-SXBX基因组3 056—6 895 bp 位置有重组事件的发生，且主要亲本为SMV-HZ1分离物（GenBank number：AJ628750.1），次要亲本为SMV-XFQ008分离物（GenBank number：KP710873.1），2个亲本均来自中国。

3 结论与讨论

半夏是一种常用的药用植物，具有很高的经济价值，然而，半夏的病害问题逐年严重，其中，病毒病害是最难防治的一种病害。病毒侵染植株后，叶片会出现花叶、褪绿斑驳、皱缩、植株矮化甚至坏死等病症，使植株的生长严重受损，长此以往将会造成植物种质退化，进而导致半夏的产量减少、品质下降^[16]。病毒侵染导致的病害在半夏产区较为常见，严重制约半夏产业的发展。已有研究表明^[17]，SMV是大豆病毒病害中最严重的病原体，破坏力极强，对大豆生产影响最重，在SMV大流行年份，受侵染的大豆种植区可能出现70%以上的严重减产，极端情况下甚至导致绝收。因此，SMV对半夏的侵染也可能造成半夏的减产。

马铃薯Y病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属（Potyvirus）成员的共同特征为种子带毒，且蚜虫是主要的传毒介体^[18]。基因组长度在10 kb左右，共编码10个蛋白质，从N端到C端分别为P1、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、NIa-VPg、NIa-Pro、NIb和CP蛋白，除此之外，还有一个P3N-PIPO蛋白，位于P3阅读框内部^[19]。本研究将SMV-SXBX的核苷酸和氨基酸序列与NCBI收录的其他SMV分离物序列进行比对分析，序列相似性分析结果表明，SMV-SXBX与SMV-Hangzhou分离物的相似性最高，核苷酸序列相似性为92.09%，氨基酸序列相似性为95.91%；系统进化分析结果也表明，SMV-SXBX和SMV-Hangzhou分离物亲缘关系最近。

植物感染SMV后，会出现花叶、斑点、叶片畸形等症状^[20]，在田间具体表现为植株矮化，叶片表现为花叶、皱缩，叶缘下卷或叶片扭曲，质地硬而脆，叶脉颜色加深变褐，两侧时常有疱状突起且症状表现以嫩叶较重^[21]。SMV的宿主范围相对较窄，大部分株系的寄主范围以大豆、蚕豆、豌豆、四季豆等豆科植物为主^[12-14]，但也有研究人员证明金花菜和紫云英是SMV的越冬寄主^[14]。自2004年，CHEN等^[22]首次发现SMV能够侵染半夏以来，越来越多的研究人员从半夏中分离得到SMV^[23-25]，但SMV能够突破豆科植物的寄主范围侵染半夏的原因还未可知，推测可能是由于SMV在进化过程中发生了某种变异。已有研究表明，SMV编码的P1^[26]、HC-Pro^[27]、P3^[28]和CP^[29]蛋白均与寄主范围有关，SMV-SXBX序列相似性分析表明，在SMV基因组编码的11个蛋白中，差异性最大的蛋白为P1蛋白，核苷酸和氨基酸序列差异性分别为34.93%和36.28%。

P1蛋白是最不保守且大小变化最大的蛋白，研究表明，SMV基因组编码的P1蛋白在不同病毒以及同一病毒不同株系间均会出现较大变异^[30]，这种非保守蛋白可能有助于病毒适应广泛的宿主物种^[31-32]。同时，HC-Pro、P3和CI蛋白中存在一些毒力决定因素，少数氨基酸突变可能导致毒力增强或丧失^[33-36]，而且大多数病毒能够通过改变其毒力决定因素以逃避宿主的检测和耐药性^[37-38]。本研究通过对不同SMV分离物的多序列比对发现，SMV-SXBX基因组具有多个由于氨基酸突变产生的功能位点，包括磷酸化、酰基化、糖基化位点等。其中，P1蛋白的251—254、299—302位点和HC-Pro蛋白的124—127位点，这些区域的氨基酸突变形成Asn-X-Thr/Ser，从而获得N-糖基化功能；P1蛋白的16—18、107—109、156—158位点，HC-Pro蛋白的332—334位点，以及CP蛋白的15—17位点，这些区域的氨基酸突变获得蛋白激酶C磷酸化功能；P1蛋白的192—195、207—210位点，HC-Pro蛋白的143—148位点，P3蛋白的315—318位点，以及CP蛋白的5—8、19—22、255—258位点，这些区域的氨基酸突变获得酪蛋白激酶II磷酸化功能；P3蛋白的179—182位点和CP蛋白的16—19位点，这些区域的氨基酸突变获得cAMP-和cGMP-依赖性蛋白激酶磷酸化功能。已有研究表明磷酸化通过蛋白质构象变化调节病毒蛋白的活性、亚细胞定位以及与胞内蛋白的相互作用，激酶的磷酸化和磷酸酶的去磷酸化会改变病毒的积累量^[39]。芜菁黄花叶病毒（Turnip yellow mosaic virus，TYMV）基因组OR1编码的RdRp蛋白的3个磷酸化位点对病毒的侵染性有显著影响，能够降低病毒基因组RNA和CP蛋白的水平，进而影响病毒的侵染能力^[40]。中国小麦花叶病毒（Chinese wheat mosaic virus，CWMV）富含半胱氨酸蛋白的2个磷酸化位点通过抑制细胞死亡和过氧化氢的产生增强病毒在植物中的侵染性^[41]。病毒蛋白的糖基化则可能引起免疫原性、致病性、宿主范围等发生变化^[42]。蛋白质的功能往往依赖于其翻译后的修饰作用，目前，SMV-SXBX基因组编码的蛋白活性验证工作正在进行中，相关结果有望为SMV异源侵染半夏的侵染机制提供线索。

基因重组在病毒进化过程中担任重要角色，BUJARSKI等^[43]首次在雀麦草花叶病毒（Brome mosaic virus，BMV）中发现了植物病毒RNA重组现象，且新基因的引入使得病毒的功能增加。基因重组会引起病毒基因组的重排以及病毒与寄主之间功能区域的转移或丧失^[44-45]，还会使病毒增强对新寄主的适应能力^[46]，尤其在马铃薯Y病毒（Potato virus Y）属病毒中的发生比较频繁。OHSHIMA等^[47]发现，在芜菁花叶病毒的76个分离物中有10%具有重组现象。REVERS等^[48]发现，在109个马铃薯Y病毒分离物中有18个具有重组现象。已有研究表明，SMV在漫长的进化过程中极易发生重组现象，与其密切相关的病毒有马蹄莲潜隐病毒（Calla latent virus，CLLV）、西瓜花叶病毒（Watermelon mosaic virus，WMV）、紫藤脉花叶病毒（Wisteria vein mosaic virus，WVMV）、菜豆普通花叶病毒（Bean common mosaic virus，BCMV）、豇豆蚜传花叶病毒（Cowpea aphid-borne mosaic virus，CABMV）和菜豆普通花叶坏死病毒（Bean common leaf necrosis virus，BCMNV）6种PVY属病毒^[49]。SEO等^[50]研究表明，由不同致病性病毒重组产生的SMV能够突破对朝鲜大豆的抗性。本研究利用RDP4软件对SMV-SXBX基因组进行重组分析，发现在其3 056—6 895 bp区域内存在重组事件，主要亲本为SMV-HZ1分离物，次要亲本为SMV-XFQ008分离物。

然而，对于SMV跨科侵染半夏的具体机制，还需要构建侵染性克隆并进行相关试验。目前，山西农业大学中药材旱作栽培与综合开发利用团队已成功构建得到SMV大豆分离物^[51]和SMV半夏分离物侵染性克隆^[52]，相关工作正在开展。本研究采用生物信息学方法对SMV-SXBX的基因组结构和功能进行分析，研究结果可为明确SMV跨科侵染半夏的机制研究奠定理论基础。

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基金资助

财政部和农业农村部：国家现代农业产业技术体系(CARS-21)