溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis，UC）是一种慢性非特异性肠道炎症性疾病，以病程较长、复发率高为特点，临床表现为腹泻、腹痛，严重时出现血便
[1]。其病理特征为结肠黏膜层和黏膜下层的连续性炎症，多始于直肠，逐渐蔓延至全结肠
[2]。近年来，UC的发病率持续攀升，已成为常见的肠道疾病
[3]。目前，临床治疗UC的主要药物存在依从性差、副作用显著等问题，严重时甚至危及生命
[4]。因此，探索安全有效且副作用小的治疗方案，对人类健康以及动物健康均具有重要意义。中药因具备改善机体状态、调节免疫功能、毒副作用小等优点，在疾病防治中应用广泛
[5]。白头翁汤作为治疗UC的经典复方，已在动物试验和临床应用中证实了其疗效
[6]，其主要通过调节肠道免疫环境、改善肠道微生态、保护黏膜屏障功能等机制发挥作用
[7]，其主要成分白头翁皂苷可通过抑制IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎因子水平，减轻葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的UC损伤
[8]。高彦明等
[9]、雷彪等
[10]和陈艾丽等
[11]通过观察白头翁汤治疗大肠湿热型UC患者病例，发现白头翁汤对大肠湿热型UC有较好的治疗效果。然而，单一白头翁汤目前存在药效起效慢的问题，在应对复杂病理状态（如肠道屏障严重受损、免疫失衡持续存在）时，应用仍有局限
12]。从作用机制来看，单一白头翁汤（核心成分如白头翁皂苷以抗炎为主）虽能调控TNF信号通路及部分促炎因子
[13]，但难以覆盖肠道屏障损伤—免疫失衡—局部缺氧的复杂病理链条
[14]。马齿苋作为兼具多种生物活性的中药，具有抗菌、抗炎、抗氧化、调节肠道稳态等作用
[15-16]，其含有的马齿苋多糖（POP）可通过调节肠道稳态缓解DSS诱导的UC病理症状
[17]，提取物还能在结肠炎小鼠模型中发挥免疫调节作用
[18]。但单一马齿苋（核心成分如槲皮素、木犀草素以抗氧化、免疫调节为主）虽可调节肠道稳态与免疫，却在抑制急性炎症放大、改善肠黏膜缺氧微环境方面作用较弱，导致其在重症UC或慢性复发期的疗效不佳
[19]。
从中医理论看，《景岳全书・痢疾》中记载UC属痢疾、肠澼范畴，核心病机为湿热蕴结肠道，气血壅滞，脉络受损。白头翁汤中，白头翁清热解毒、凉血止痢为君，黄连、黄柏清热燥湿为臣，秦皮收涩止痢为佐使，共同发挥清湿热、止痢痛的疗效，但针对湿热久羁、肠络损伤的重症UC，其凉血止血、修复肠络的疗效稍逊。马齿苋性味酸寒，归肝、大肠经，《本草纲目》载其具有散血消肿，利肠滑胎，解毒通淋的功效，既能助君药增强清热解毒之功，又能通过酸敛特性止血护络，契合UC湿热痢兼见便血的病机特点
[20]。马齿苋与白头翁汤（清热解毒、凉血止痢）
[21]配伍，符合“君臣佐使”理论中“佐药助君、增效减毒”的原则，可增强清利肠道湿热的作用，形成清湿热—止痢痛—护肠络的协同作用链，契合UC湿热痢的病机治疗原则
[22]。
白头翁和马齿苋的核心成分功效各有侧重，或因清热凉血有余而利湿不足，或因利湿止痢尚可而清热凉血欠缺，均无法形成抗炎—抗氧化—屏障修复的协同效应，难以全面应对UC的多环节病理机制。相比之下，加味白头翁汤（Supplemented pulsatilla decoction，SPD）通过白头翁汤与马齿苋的配伍，可弥补单一方剂的缺陷，形成更全面的治疗体系。但二者配伍后的协同作用机制尚未明确。
本研究在经典白头翁汤基础上加入马齿苋形成加味白头翁汤，通过网络药理学筛选其治疗UC的核心成分—潜在靶点—通路，旨在为中药复方“君臣佐使”配伍的现代生物学阐释提供参考，并为SPD治疗UC的临床应用奠定理论基础。
1 材料和方法
1.1 SPD活性成分及靶点预测
在TCMSP数据库（
https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）中分别输入马齿苋、白头翁、黄连、黄柏、秦皮进行检索，以口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%和药物相似性（Drug-likeness，DL）≥0.18为条件筛选化学成分及对应蛋白靶点；对满足上述筛选条件但无对应靶点的成分使用PubChem网站（
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）对其进行结构查找，根据结构式使用Swiss target prediction网站（
http://swisstargetprediction.ch/）进行靶点预测，使用UniProt网站（
https://uniprot.org/）将各化学成分靶点匹配其对应基因名称，使蛋白质靶点信息标准化。
1.2 溃疡性结肠炎疾病靶点及药物—疾病交集靶点获取
利用Geencards（
http://www.genecards.org/）、Disgenet（
https://www.disgenet.org/search）及Ctd（
http://ctdbase.org/）数据库，以“Ulcerative colitis”为关键词分别对其所收纳的疾病靶点进行查找，将各数据库得到的疾病相关基因通过Venn 2.1.0软件进行构图，获取交集靶点作为该疾病的靶点。以同样的方法使用Venn 2.1.0对药物预测潜在靶点与疾病相关靶点取交集，获得SPD对UC的潜在作用靶点。
1.3 交集靶点互作关系构建
将交集靶点输入到STRING网站（
https://cn.string-db.org/）中的Multiple proteins选项中，进行各蛋白互作紧密程度分析，物种设置为
Mus musculus，最低相互作用阈值设为高置信度High confidence（0.7），即获得蛋白互作关系图，结果以TSV格式导出并进行分析计算，提取网络中得分较高的节点，取前10个互作频次最高的靶点为关键作用靶点，在微生信平台（
https://www.bioinformatics.com.cn/plot_basic_cluster_heatmap_plot_024）对关键靶点进行作图分析。
1.4 中药调控网络及蛋白质相互作用网络构建
将加味白头翁SPD的主要活性成分与潜在靶点导入Cytoscape 3.8.2软件中，基于介数中心性、接近中心性、度中心性和特征向量中心性等网络参数分析该网络的拓扑，并绘制中药—活性成分—潜在靶点网络图。
1.5 GO功能及KEGG通路富集分析
在DAVID（
https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp）网站内输入交集靶点，选择标识符OFFICIAL-GENE-SYMBOL，物种选择
Mus musculus，提交获得功能分析工具，下载GO和KEGG通路进行富集分析。根据基因富集度分析，在微生信平台内构建KEGG气泡图和GO富集分析图。
2 结果与分析
2.1 SPD活性成分和交集靶点分析
在OB≥30%、DL≥0.18和小鼠为对象的条件下，5种SPD成分在TCMSP数据库中共检索出75种成分，其中，马齿苋10种、白头翁11种、黄连14种、黄柏37种、秦皮3种。去除重复项后获得60种活性成分（
表1）。这些成分在TCMSP数据库共匹配到411个药物靶点，其中，马齿苋222个、白头翁332个、黄连286个、黄柏380个、秦皮12个。然后使用Geencards、Disgenet及Ctd数据库分别富集到5 027、1 460、18 098个疾病靶点，通过比较分析，获得975个交集靶点作为疾病靶点（
图1-A）。再取疾病靶点与SPD靶点交集，共获得43个靶点（
图1-B），即为SPD治疗UC的潜在靶点。
2.2 交集靶点互作关系及核心靶点筛选
将交集靶点导入STRING进行蛋白质互作网络分析（
图2-A），将结果导出后，取互作频次最高的前10个蛋白，筛选出SPD治疗UC的核心靶点为：Alb、IL-6、TNF、Caspase3、Egf、IL-10、Mmp9、Trp53、Ifng和MAPK14（
图2-B）。
2.3 SPD与UC交集靶点互作关系
将药物与疾病的交集靶点和药物的活性成分导入Cytoscape软件，构建SPD与UC之间的成分—靶点—通路网络（
图3）。其中，槲皮素（Quercetin）和木犀草素（Luteolin）具有最高的连接性，其度数值分别为30和20，可能在治疗UC中发挥关键作用。
2.4 GO和KEGG富集分析
为了进一步研究SPD抗UC作用的机制，使用DAVID网站进行GO功能和KEGG通路分析。选取
P值最小的前10个GO条目从生物过程（Biological process，BP）、细胞成分（Cellular component，CC）和分子功能（Molecular function，MF）3个方面进行分析（
图4）。在BP项目中，SPD的抗UC作用主要集中在基因表达正调控、对药物的反应、细胞凋亡过程的正、负调控、细胞凋亡过程、DNA模板化、衰老、细胞增殖调控和蛋白质磷酸化的调控。MF项目主要包括蛋白结合、金属离子结合、酶结合、锌离子结合、细胞因子活性、大分子配合物结合、水解酶活性、蛋白质同源二聚体活性和蛋白酶的结合。CC项目主要包括细胞外、细胞质、细胞核、线粒体等，表明药物治疗的途径能在膜表面、胞质内、细胞核及线粒体等多个部位进行。
KEGG途径分析中选取前20个通路进行分析，结果发现（
图5），与UC有关的通路主要包括癌症通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、脂质与动脉粥样硬化、疟疾、锥虫病、弓形虫病、乙肝、结核病、炎性肠病、HIF-1信号通路、TNF信号通路、Mark信号通路等。其中，炎性相关通路TNF、Mark得到富集，表明其可能在SPD治疗UC中发挥重要作用。
3 结论与讨论
溃疡性结肠炎是炎性肠病的一种，目前尚无特效的治疗手段，只能通过缓解症状来改善生活质量。因此，探究能有效治疗UC的药物对于临床治疗来说是当务之急。网络药理学技术是基于疾病—药物—交集靶点—相关通路的方式进行研究，其可揭示药物在治疗疾病中涉及的可能靶点及靶点间的互作关系，从而为解决医学上复杂疾病和新药的探索提供理论支持
[23]。本研究利用网络药理学技术初步分析了加味白头翁汤治疗UC的潜在机制，揭示了SPD通过多靶点协同调控UC的优势。
SPD是一种重要复方，具有多靶点治疗的特点，而UC的发生也受多种因素的调节。本研究利用网络药理学药物和疾病靶点交互作用分析，预测出了10种SPD和UC交互作用的核心靶点Alb、IL-6、TNF、Caspase3、Egf、IL-10、Mmp9、Trp53、Ifng和MAPK14。Alb是反映肠道吸收功能和营养状态的关键指标
[24]。古丽不斯旦·吾守尔等
[23]通过收集UC患者和健康体检者病例，发现UC患者因结肠黏膜损伤导致Alb合成减少，且并发营养不良，其水平与疾病活动度负相关。本研究发现，SPD对UC诱导的Alb水平变化具有调节作用，表明SPD可能有助于缓解UC患者全身营养失衡的状态，其机制可能与白头翁汤修复黏膜屏障
[25]和马齿苋调节肠道稳态
[26]有关。IL-6、TNF作为促炎因子网络的核心，在UC活动期显著升高
[27-28]。张锦鹏等
[29]也通过对代谢性、肿瘤等多种疾病的研究发现，IL-6、TNF可通过激活NF-κB等通路放大炎症反应。MAPK14在细胞信号传导中具有重要作用，其可参与炎症、衰老、分化、细胞凋亡、增殖等多种生物学过程
[30]。ZHENG等
[31]通过研究中医治疗UC的机制发现，治疗UC的经典方剂如清肝利肠汤和左金丸可以通过调节MAPK等信号通路缓解UC导致的结肠损伤。本研究发现，SPD可调节UC引起的MAPK14表达的变化，其机制可能与槲皮素抑制MAPK通路活性相关
[32]。Ifng是Th1型免疫应答的核心细胞因子，FOUAD等
[33]通过乙酸诱导小鼠UC模型，发现维格列汀（Vilda）可以通过降低Ifng在UC中过度表达调节免疫失衡，缓解UC症状。本研究发现，SPD可调节UC引起的Ifng表达变化，其机制可能与马齿苋中木犀草素调节Th1/Th2平衡的作用相关
[34]。IL-10是一种抗炎因子，具有维持肠道免疫平衡的作用
[35]，这种平衡是缓解UC肠道稳态紊乱的关键。袁力等
[36]研究发现，木犀草素可通过上调IL-10水平缓解葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导小鼠溃疡性结肠炎。本研究发现，SPD可调节UC引起IL-10表达的变化，这种调节作用可能与SPD中活性成分木犀草素的免疫调节作用相关。Caspase3是细胞凋亡的执行蛋白，王倩等
[37]研究发现，其过度激活会导致UC患者结肠黏膜上皮细胞异常死亡，导致肠黏膜修复障碍
[37]；Egf是上皮修复的关键因子，WANG等
[38]研究发现，贻贝类黏附的热敏水凝胶可通过巨噬细胞极化增强Egf对2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的UC大鼠结肠黏膜屏障的非纤维化修复作用。Caspase3和Egf的平衡调控是黏膜愈合的关键。本研究发现，SPD对Caspase3和Egf有潜在的调节作用，且GO富集分析结果也显示，SPD对细胞凋亡过程有潜在的调节作用，表明SPD可能通过调节UC诱发的黏膜“破坏>修复”的病理失衡状态，改善UC导致的结肠黏膜损伤。Mmp9是一种基质金属蛋白酶，薛永举
[14]研究发现，Mmp9过度激活时会通过降解结肠黏膜基质破坏UC患者的结肠黏膜屏障发挥作用。本研究发现，SPD对Mmp9有潜在的调节作用。Trp53是小鼠体内与人类Tp53基因相对应的同源基因，具有重要的肿瘤抑制功能。TANG等
[39]通过基因工程小鼠构建人类结直肠癌（CRC）模型，比较了常见的人类癌，发现Trp53功能异常可能参与UC向结肠癌转变。本研究发现，SPD对Trp53有潜在的调节作用。上述靶点共同构成UC病理链炎症发作—细胞异常死亡—肠道屏障受损的核心
[40]。本研究发现，SPD对上述靶点具有调控作用，这既体现了SPD对UC发生关键环节的精准干预，又符合中药整体调节的特点。
本研究通过网络药理学发现，槲皮素和木犀草素是SPD的核心活性成分，与其他核心靶点交互频次最高，这些活性成分是复方优势的物质基础。李钦等
[41]通过醋酸诱导大鼠UC模型发现，槲皮苷通过降低结肠黏膜MDA及MPO水平减轻UC损伤。李越
[42]通过DSS诱导的小鼠UC模型，发现木犀草素通过抑制TNF-α、IL-6等促炎因子表达和上调IL-10表达，增强免疫保护作用，从而缓解UC损伤。槲皮素强大的抗氧化能力
[43]与木犀草素的免疫调节功能
[44]在SPD中通过协同作用于TNF、MAPK等靶点，形成抗氧化—抗炎的协同网络，弥补了单纯白头翁汤（侧重抗炎）或马齿苋（侧重免疫调节）的局限性。白头翁汤虽能调控TNF通路
[13]，但对氧化应激的干预较弱；马齿苋虽含槲皮素等抗氧化成分
[17]，却在抑制急性炎症放大方面作用有限
[19]。表明槲皮素和木犀草素可能是SPD对UC潜在治疗作用的核心成分。
为进一步分析SPD调控UC的潜在机制，本研究进行了KEGG富集分析，结果显示，SPD可调控UC引起的TNF-α、MAPK及HIF-1信号通路的变化。其中，TNF通路是UC炎症放大的核心通路
[45]，ZHANG等
[46]通过葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的小鼠UC模型，发现白头翁橄榄烷型皂苷可以通过抑制TNF-α信号通路减少下游炎症因子释放，从而改善体内肠上皮细胞屏障和肠道菌群来缓解UC症状。WANG等
[47]通过DSS诱导的小鼠UC模型，发现Harvey大鼠肉瘤病毒癌基因同源物沉默（HRas沉默）可以抑制MAPK通路活化，恢复UC中的Treg/Th17细胞平衡，减轻UC黏膜损伤。HIF-1是低氧适应和病理反应中一个特异的中介因子。胡来明等
[48]通过测定UC患者和健康体检者结肠组织中HIF-1α、iNOS的表达及与疾病活动性的关系，发现Hif-1α、iNOS的表达与UC患者疾病活动度呈正相关。本研究发现，SPD可调控UC引起的TNF-α、MAPK及HIF-1信号通路的变化，表明SPD可通过调控炎症、免疫、氧化应激等多种生物过程调节UC症状。
本研究利用网络药理学技术系统解析了SPD治疗UC的多成分—多靶点—多通路潜在机制。SPD可能主要是通过槲皮素、木犀草素，作用于Alb、IL-6、TNF、Caspase3、Egf、IL-10、Mmp9、Trp53、Ifng和MAPK14等关键靶点调控TNF-α、MAPK及HIF-1等多个信号通路来对UC进行治疗。但网络药理学结果仅为预测，仍需进一步试验验证。
京公网安备11010202008535号
PDF
(2683KB)
