G3基因群猪博卡病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立及应用

Development and Application of SYBR Green Ⅰ Fluorescent Quantitative PCR Assay for Detecting the G3 Genogroup of Porcine Bocavirus

摘要

猪博卡病毒（Porcine bocavirus，PBoV）广泛存在于全球猪群中，其中，G3基因群（PBoV G3）会导致猪群发生腹泻，已成为威胁养猪业的重要病原。为了建立一种高效的PBoV G3检测方法，为深入揭示PBoV G3的流行特征及相关疾病防控提供可靠的技术支持，研究基于GenBank收录的PBoV G3 VP1基因保守区设计特异性引物，并以重组质粒pCE3 Blunt-VP1为标准模板，经条件优化构建了检测PBoV G3的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR（qPCR）检测方法。方法学评价结果表明，该体系可实现4.51拷贝/μL的最低检测限，灵敏度较常规PCR提高约100倍；对PBoV G1、PBoV G2及多种常见猪肠道病毒均无交叉扩增，特异性良好；批内和批间变异系数均小于2%，重复性稳定。临床样品检测结果显示，在212份腹泻猪粪便中，该方法的检出率为41.0%（87/212），显著高于常规PCR的33.5%（71/212），二者符合率达92.5%。综上所述，该方法兼具灵敏、特异和稳定的优势，适合大规模临床样品筛查。

Abstract

Porcine bocavirus(PBoV) is widely prevalent in swine populations worldwide, among which the G3 genogroup(PBoV G3) has been associated with diarrheal outbreaks and has emerged as an important pathogen threatening the swine industry. To develop an efficient method for PBoV G3 detection, in this study, specific primers targeting the conserved region of the VP1 gene were designed based on sequences available in GenBank, and a recombinant plasmid(pCE3 Blunt-VP1) containing the VP1 gene fragment was constructed as a standard template. Following optimization of reaction conditions, a SYBR Green I-based fluorescent quantitative PCR(qPCR) assay was established to detect PBoV G3. Methodological evaluation demonstrated that the assay achieved a minimum detection limit of 4.51 copies/μL, with a sensitivity approximately 100-fold higher than that of conventional PCR. No cross-reactivity was observed with PBoV G1, PBoV G2, or other common porcine enteric viruses, indicating high specificity. Both intra-and inter-assay coefficients of variation were below 2%, confirming good repeatability. Application to clinical samples revealed that the detection rate of PBoV G3 using the established qPCR was 41.0%(87/212) in diarrheic fecal specimens, significantly higher than 33.5%(71/212) obtained by conventional PCR, with a concordance rate of 92.5% between the two methods. In conclusion, this assay combined high sensitivity, strong specificity, and reliable stability, making it suitable for large-scale clinical sample screening. It provided a robust technical tool for elucidating the epidemiological characteristics of PBoV G3 and supporting related disease prevention and control efforts.

Graphical abstract

关键词

猪博卡病毒 / G3基因群 / SYBR Green I / qPCR

Key words

porcine bocavirus / G3 genogroup / SYBR Green I / qPCR

2009年，瑞典学者首次在猪群中发现猪博卡病毒（Porcine bocavirus，PBoV），该病毒在全球猪群中广泛流行^[1]，在中国、越南、巴西、澳大利亚、马来西亚等多个国家被报道^[2-7]，多种不同PBoV毒株在患有仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）、呼吸道疾病及腹泻的猪群中均有发现^[8-9]。PBoV属于细小病毒科（Parvoviridae）细小病毒亚科（Parvovirinae）的博卡病毒属（Bocavirus）^[10]，通常与仔猪腹泻和上呼吸道感染有关，易与猪圆环病毒2型、猪细小病毒等发生共感染，其被认为具有潜在的免疫抑制功能^[8，11-12]。PBoV有3个主要的开放阅读框，编码非结构蛋白NS1、NP1和结构蛋白VP1、VP2^[13-14]，其中VP1具有独特的N-末端区域（VP1u），包含1个酶活性的磷脂酶A2基序（PLA2），对于病毒对宿主细胞的特异性、细胞内运输和核定位至关重要^[10]。2012年YANG等^[15]提出了一种基于VP1基因的PBoV分类方法，将PBoV分为3个基因群，即PBoV G1、PBoV G2和PBoV G3。

近期研究显示，我国猪群中PBoV G3的感染率高于PBoV G1和PBoV G2，且PBoV G3多与猪群腹泻紧密相关^[16-17]。孙晓瑜等^[16]对不明原因的仔猪腹泻病例进行病毒宏基因组检测，发现样品中主要检出PBoV，而未发现猪常见的腹泻病毒，提示其可能是腹泻的主要病原。ARYAL等^[17]通过动物攻毒试验发现，饲喂PBoV阳性肠内容物的缺乳仔猪出现明显腹泻，并在小肠组织中检测到病毒和病变，证实了PBoV具有致病性。然而，目前因缺乏PBoV体外分离与传代细胞系，其具体致病机制尚待阐明。更值得关注的是，PBoV的宿主范围已出现扩展，在人类和水貂中均有检出，显示其可能突破物种屏障，给畜牧业生产和公共卫生防控带来新的挑战^[18-19]。因此，急需建立一种高效、灵敏且经济的PBoV G3检测方法，以更好地开展其监测与防控。

LI等^[20]建立了针对PBoV NS1基因的TaqMan qPCR方法，具备准确、灵敏、快速的优点。然而，早期GenBank数据库中可供参考的PBoV基因序列有限，且该病毒持续变异，遗传多样性丰富，导致现有检测方法普遍存在灵敏性不高或成本较高等局限。鉴于PBoV G3在猪群中广泛传播且对猪群危害严重，目前临床上仍缺乏一种针对该基因群PBoV的高效检测手段。

本研究针对GenBank数据库中最新的48条PBoV G3的VP1基因序列，筛选出同源性较好的一段VP1保守区域并设计引物，建立检测PBoV G3的SYBR Green I qPCR方法，旨在为PBoV G3的定量检测和疫情防控提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 毒株与样品

猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）由平顶山市动物生物医药工程技术研究中心分离保存；PBoV的G1、G2、G3共3个基因群的阳性病料由平顶山市动物生物医药工程技术研究中心鉴定并保存；212份来自河南省不同地区猪场的腹泻猪粪便样品，由平顶山市动物生物医药工程技术研究中心收集并保存。此外，从平顶山市畜牧业发展中心获得5份经鉴定的PBoV G3阳性猪粪便样品和5份阴性粪便样品，用于临床样品检测中准确性和特异性的进一步验证。

1.1.2 主要试剂

FastPure Viral DNA/RNA Mini Kit（RC311-01）、Ultra-Universal TOPO Cloning Kit（C603-01）、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（P505-d1）、质粒小提试剂盒（DC201-01）、2×Rapid Taq Master Mix（P222-01）、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Q711-02）均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；DH-5α感受态细胞由平顶山市动物生物医药工程技术研究中心制备并保存。

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计

根据GenBank中登录的48条PBoV G3的VP1基因序列，利用MEGA 11软件对VP1基因片段进行同源性分析。为提高检测的覆盖率与适用性，根据PBoV G3 VP1基因序列的高度保守区，使用Primer 6.0软件设计简并引物（PBoV-qPCR-F/PBoV-qPCR-R），用于建立qPCR方法。引物序列如表1所示，引物由通用生物（安徽）股份有限公司合成。为验证引物的特异性，本研究将引物结合区与PBoV G1、PBoV G2和PBoV G3各8条代表性序列进行比对，并进一步通过NCBI BLAST分析，确认所设计引物的特异性。

1.2.2 重组质粒标准品的构建与鉴定

取0.5 g保存的呈PBoV G3阳性的猪粪便样品，加入2 mL无菌PBS，涡旋仪充分振荡后12 000 r/min离心5 min；取200 μL离心后上清液，按照FastPure Viral DNA/RNA Mini Kit试剂盒说明书提取病毒DNA，以PBoV-qPCR-F/PBoV-qPCR-R为引物，采用Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase PCR扩增PBoV G3的VP1基因部分片段，PCR产物纯化后连接至pCE3 Blunt Vector，构建重组质粒标准品pCE3 Blunt-VP1，测定其浓度，计算质粒拷贝。

1.2.3 荧光定量PCR条件优化

参照ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix推荐的扩增条件和反应体系，采用矩阵法对引物PBoV-qPCR-F/PBoV-qPCR-R（10 μmol/L）的体积（0.2~1.0 μL，梯度为0.2 μL）和退火温度（58~65 ℃，梯度为1 ℃）进行优化。

1.2.4 标准曲线和熔解曲线的建立

将构建的重组质粒标准品pCE3 Blunt-VP1按照10倍倍比关系进行稀释（10⁴~10¹⁰），用优化后的qPCR测定反应数据。绘制标准曲线时以Cq值为纵坐标、质粒拷贝数的对数值为横坐标。同时生成反应的熔解曲线。

1.2.5 特异性试验

PBoV的G1、G2、G3基因群的阳性猪粪便样品的处理同1.2.2，使用FastPure Viral DNA/RNA Mini Kit提取PBoV的G1、G2、G3基因群阳性样品DNA，提取PEDV、PDCoV和TGEV总RNA，反转录成cDNA。使用本研究建立的qPCR方法对PEDV、PDCoV、TGEV的cDNA和PBoV G1、PBoV G2、PBoV G3的DNA及ddH₂O进行检测，检验qPCR特异性。

1.2.6 灵敏性试验

以10倍倍比稀释（10⁴~10¹⁰）的pCE3 Blunt-VP1质粒为模板，采用本研究建立的qPCR，建立实时反应曲线；同时使用本研究已设计合成的PCR引物通过常规PCR对梯度稀释的重组质粒标准品进行检测。通过对比qPCR出现阳性信号的最大稀释倍数和常规PCR凝胶电泳出现阳性条带的最大稀释倍数，比较二者的灵敏性，确定该qPCR方法的灵敏度。

1.2.7 重复性试验

以10倍倍比稀释（10⁴~10¹⁰）的pCE3 Blunt-VP1质粒为模板，用优化后的qPCR反应体系和反应条件分别做3个平行试验，进行批内重复试验；另在3个时间对各样品进行3个重复检测，为批间重复试验，记录数据。根据计算出的批内变异系数和批间变异系数，评估其重复性。

1.2.8 临床样品的检测

为评估该方法在实际临床样品中的应用效果，采集来自河南省不同地区猪场的212份腹泻猪粪便样品，样品处理同1.2.2，使用FastPure Viral DNA/RNA Mini Kit提取DNA，利用该qPCR方法和常规PCR方法分别进行检测，统计检测结果，计算二者的符合率。同时，对来自平顶山市畜牧业发展中心的5份已知PBoV G3阳性样品和5份已知阴性对照样品进行检测，进一步评估该方法的准确性和特异性。

1.3 数据分析

利用Microsoft Excel 2022进行数据处理，采用Adobe Illustrator进行绘图。

2 结果与分析

2.1 引物序列比对结果

引物序列比对结果显示，PBoV G3 VP1基因整体变异较大，即使在相对保守区段也存在差异。正向引物序列区在所分析的PBoV G3序列中较为一致，而在PBoV G1和G2中存在明显差异（图1-A，黑色方框内序列）。反向引物结合区在PBoV G3中可见个别碱基差异，但通过简并引物设计能够覆盖其内部多样性，同时该区域在G1和G2中同源性较低（图1-B，黑色方框内序列）。此外，NCBI BLAST分析结果显示，2条引物仅与PBoV G3序列显著匹配，未与PBoV G1或PBoV G2序列形成有效匹配。

2.2 重组质粒标准品的鉴定结果

以PBoV G3阳性的猪粪便样品提取的DNA为模板，PCR扩增PBoV G3的VP1基因部分片段，连接至pCE3 Blunt Vector载体，再通过PCR扩增和测序进行鉴定，结果扩增出167 bp目的片段（图2），且测序正确，表明成功构建pCE3 Blunt-VP1重组质粒标准品。测定质粒质量浓度为97.2 ng/μL，计算拷贝数为4.51×10¹⁰拷贝/μL。

2.3 荧光定量PCR条件的优化

qPCR反应条件优化结果显示，引物最优用量均为0.4 μL（浓度10 μmol/L），退火最优温度为61 ℃。优化后的最佳体系为20 μL：预混酶10 μL，每条引物均0.4 μL，ddH₂O 8.2 μL，DNA模板1 μL。优化后的最佳扩增温度为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s,61 ℃ 15 s，共扩增40个循环。

2.4 标准曲线的建立和熔解曲线分析

以不同浓度质粒pCE3 Blunt-VP1（4.51×10⁶~4.51×10⁰拷贝/μL）为模板，进行qPCR扩增，根据扩增数据绘制标准曲线（图3-A），标准曲线方程是y=-4.079 1x+37.300 0（R=0.993 4）。说明各梯度质粒浓度与Cq值之间呈良好线性关系。熔解曲线的结果显示，该方法的熔解曲线峰较为统一，平均熔解温度约为86 ℃，前后波动不超过1 ℃（图3-B）。

2.5 特异性试验结果

用该qPCR方法对PEDV、PDCoV、TGEV、PBoV G1、PBoV G2、PBoV G3病毒的DNA或cDNA进行扩增，并设置ddH₂O为阴性对照进行检测，只有PBoV G3扩增出高水平的荧光信号，其他样品均无扩增反应（图4），该方法显示出较强的特异性。

2.6 灵敏性试验结果

分别用该qPCR与常规PCR检测方法对浓度梯度为4.51×10⁶~4.51×10⁰拷贝/μL的重组质粒标准品进行扩增，结果显示，qPCR最低可检测到4.51拷贝/μL的DNA模板（图5-A），而常规PCR检测下限为4.51×10²拷贝/μL（图5-B）。该qPCR是常规PCR灵敏性的100倍，表明其灵敏性较高。

2.7 重复性试验结果

以4.51×10⁶~4.51×10⁰拷贝/μL的重组质粒标准品为模板，使用该qPCR方法分别进行批内和批间重复试验，结果显示，批内变异系数在0.5%以内，批间的变异系数在2%以内（表2），表明重复性较好。

2.8 临床应用检测结果

利用建立的qPCR和常规PCR分别对来自河南省的212份临床腹泻猪粪便样品进行检测，结果显示，qPCR的PBoV G3检出率为41%（87/212），阴性率为59%（125/212）；常规PCR的PBoV G3检出率为33.5%（71/212），阴性率为66.5%（141/212），阴性符合率为88.7%，阳性符合率为100%，总符合率为92.5%。表明该qPCR方法更灵敏，可以广泛用于PBoV G3的临床检测。此外，为进一步验证检测方法的准确性和特异性，本研究选取了来自平顶山市畜牧业发展中心的5份PBoV G3阳性猪粪便样品和5份阴性样品进行检测；结果显示，阳性样品均获得正确检出，阴性样品均未检出PBoV G3，未出现假阳性或假阴性，充分证明该方法在临床样品检测中的可靠性和特异性。

3 结论与讨论

近年来，PBoV在世界范围内被广泛报道，并与猪群的腹泻、呼吸道疾病及混合感染相关，并出现跨物种传播，对养猪业和公共卫生均构成潜在威胁^[18，21-24]。已有研究表明，在我国猪群中，PBoV G3的检出率高于PBoV G1和PBoV G2基因群，并可导致猪群发生腹泻^[16-17]。在本研究中，PBoV G3在腹泻样品中的检出率达到41%，明显高于常规PCR的检出率（33.5%），进一步说明其在临床病例中的广泛流行，也凸显了建立高效检测方法的必要性。

方法学性能方面，本研究建立的SYBR Green I qPCR方法展现出较大优势。灵敏度方面，该方法最低检出限为4.51拷贝/μL，较常规PCR提高约100倍，达到了目前同类研究的先进水平。特异性方面，本研究通过检测PBoV G1、PBoV G2、PBoV G3及多种常见猪肠道病毒，结果显示，仅PBoV G3扩增出阳性信号，证明了所设计引物的高度特异性。重复性方面，无论批内还是批间试验，变异系数均小于2%，表明该方法稳定可靠。之前国内学者建立了基于TaqMan探针的PBoV G3 qPCR检测方法^[20]，其灵敏度达到20拷贝/μL水平，展现出良好的检测性能，在相关研究中发挥了重要作用。而本研究构建的基于SYBR Green I染料法的PBoV G3 qPCR检测方法，经过PBoV G3高度保守区引物设计和试验条件优化，在灵敏度方面取得了进一步提升，达到了4.51拷贝/μL的高灵敏度水平。相比于TaqMan探针法，本方法没有复杂且造价昂贵的探针，节省了检测成本^[25-27]，同时在灵敏度上实现了进一步提升，显示出较高的经济性和可推广性。

值得注意的是，由于PBoV G3 VP1基因整体变异较大，即使在相对保守区段亦存在碱基差异，本研究在正反向引物设计中均引入了简并碱基，以增强检测对不同PBoV G3毒株的覆盖性。通过多序列比对与NCBI BLAST分析，确认了引物仅与PBoV G3序列匹配，进一步保障了引物特异性。此外，在应用该方法进行临床样品检测时，增加了5份已知阳性和5份已知阴性对照样品，结果显示，对照样品与其已知状态完全一致，进一步验证了该方法的准确性和特异性。

从临床和流行病学角度看，本研究显示，PBoV G3在腹泻样品中检出率较高，提示其在猪群腹泻病例中可能发挥重要作用。既往研究显示，PBoV的致病机制可能与VP1u区的PLA2基序相关，该结构既参与病毒DNA的复制，也可能影响病毒的致病性，但由于当前尚缺乏适合的体外分离与传代体系，其机制仍需进一步研究。本研究建立的高灵敏度检测方法为未来揭示PBoV G3的流行规律和潜在致病作用提供了可靠工具。

综上所述，本研究建立的SYBR Green I qPCR方法在灵敏度、特异性和重复性方面均表现优异，显著提升了PBoV G3的检出效率。该方法不仅适合实验室常规检测，也能应用于临床诊断和大规模流行病学调查，为PBoV G3的持续监测和疫情防控提供了重要的技术支持。

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基金资助

河南城建学院科教融汇项目(K-X2025046)