晋汾白猪CXXC5基因的生物信息学分析及表达

Bioinformatics Analysis and Expression of CXXC5 Gene in Jinfen White Pig

摘要

CXXC5是一种含有CXXC型锌指结构域的蛋白质，参与多种生物学过程，在基因表达调控中发挥重要作用。为研究CXXC5基因的生物学特性及其在晋汾白猪骨骼肌不同发育阶段和不同组织中的表达差异，通过多种生物信息学软件对CXXC5基因进行分析，包括蛋白质理化性质、亚细胞定位、信号肽预测、二级和三级结构特征等。基于1、90 d和180 d晋汾白猪的背最长肌组织转录组测序数据，构建了CXXC5基因的表达谱，并通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）评估了90 d晋汾白猪心、肝、脾、肺、肾、背肌、背脂组织中CXXC5基因的表达水平。生物信息学分析结果显示，猪CXXC5蛋白分子质量为32 968.81 u，等电点为9.35，主要定位于细胞核，是一种亲水性非分泌蛋白且不稳定，无规则卷曲、α-螺旋和延伸链是构成该蛋白二级结构和三级结构的主要方式。qRT-PCR结果显示，CXXC5基因在背最长肌中90 d表达量最高，180 d表达量最低；在肝脏中的表达量显著高于其他组织，其次是背肌，在肺脏中相对表达量较低。综上，CXXC5在骨骼肌不同发育阶段中的表达具有显著差异，其是骨骼肌生长发育过程中的重要调控因子之一。

Abstract

CXXC5 is a protein containing CXXC-type zinc finger domain, which is involved in many biological processes and plays an important role in gene expression regulation. In order to study the biological characteristics of CXXC5 gene and its expression differences in different developmental stages and tissues of Jinfen white pig skeletal muscle, in this study, a comprehensive analysis of CXXC5 gene was carried out by a variety of bioinformatics software, including protein physicochemical properties, subcellular localization, signal peptide prediction, and secondary and tertiary structure characteristics. Based on the transcriptome sequencing data of longissimus dorsi of 1 d, 90 d, and 180 d Jinfen white pigs, the expression profile of CXXC5 gene was constructed, and the expression level of CXXC5 gene in heart, liver, spleen, lung, kidney, back muscle, and back fat tissues of 90 d Jinfen white pigs was evaluated by real-time quantitative fluorescent PCR(qRT-PCR). The results of bioinformatics analysis showed that porcine CXXC5 protein was with molecular weight of 32 968.81 u and isoelectric point of 9.35, mainly located in the nucleus, was a hydrophilic non-secreted protein and unstable. Random coil, α helix, and extended strand were the main ways to constitute the secondary and tertiary structure of this protein. The results of qRT-PCR showed that the expression of CXXC5 gene was the highest in longissimus dorsi at 90 d and the lowest at 180 d. The expression level was significantly higher in liver than that in other tissues, followed by back muscle, and relatively low in lung. In conclusion, the expression of CXXC5 was significantly different in different developmental stages of skeletal muscle, and it was one of the important regulatory factors in the growth and development of skeletal muscle.

Graphical abstract

关键词

晋汾白猪 / CXXC5基因 / 生物信息学 / 蛋白质理化性质 / 亚细胞定位 / 信号肽预测

Key words

Jinfen white pig / CXXC5 gene / bioinformatics / protein physicochemical properties / subcellular localization / signal peptide prediction

猪肉因价格适中，味道美味，成为最受欢迎的肉类之一^[1]。在我国畜牧业中，生猪产业一直占据着重要的地位，并对我国的国计民生起着至关重要的作用^[2]。动物的骨骼肌是肉产品的主要来源，约占体质量的40%，是机体最大的组织和主要的代谢活动场所，为人类提供了优质的动物蛋白和营养物质^[3]。在过去的几十年里，提高猪的生长速度和肌肉质量，一直是畜牧养殖领域关注的重点^[4]。骨骼肌的生长发育是影响猪肉品质的关键，也一直是动物遗传育种领域研究的重点之一。

CXXC5是一种含有CXXC锌指结构域（ZF-CXXC）的蛋白家族成员。CXXC结构域的研究始于20世纪90年代，科学家发现该结构域能够特异性结合DNA，尤其是在未甲基化的CpG岛区域，从而在表观遗传调控中发挥关键作用^[5]。CXXC5作为CXXC家族成员之一，其研究起步较晚。21世纪初，CXXC5基因在人类和小鼠中的克隆及其在发育和疾病中的功能研究逐渐展开。CXXC5能够调节包括TGF-β^[6]、Wnt^[7]和ATM-p53^[8]在内的多种信号转导过程，在成骨细胞和人皮肤细胞中与Dvl蛋白相互作用，抑制Wnt/β-catenin信号途径，影响成骨细胞的发育和皮肤创伤的愈合^[9]。CXXC5通过调控细胞增殖、分化和凋亡，在组织发育与稳态中发挥着至关重要的作用。已有研究使用荧光素酶基因报告基因筛选CXXC5可能参与的信号通路，发现CXXC5的过表达显著增加了心脏和骨骼肌分化信号通路报告基因的转录活性，而CXXC5的RNAi干扰明显与过表达测定的结果相反^[10]。在心房颤动大鼠心肌纤维化中的表达及其对心肌纤维化的影响及可能机制的研究中，发现过表达CXXC5可通过抑制TGF-β1/Smad7信号通路，从而抑制心房颤动大鼠心肌纤维化，证明了CXXC5是心房颤动心肌纤维化的潜在靶点^[11]。

此外，CXXC5的研究还聚焦于探究其在疾病中的潜在作用和临床意义^[12]。已有研究表明，CXXC5-ZNF143/EGR1轴形成驱动卵巢细胞增殖和肿瘤发生的网络，并强调CXXC5是卵巢癌治疗的潜在治疗靶点^[13]；CXXC5能够抑制炎症性肠病的发生，促进肠上皮细胞的损伤修复，是控制肠炎发生的一个重要调控子^[14]。

晋汾白猪是将马身猪、二花脸猪、长白猪和大白猪作为亲本，通过杂交选育而成的一种新品种，具有肉质好、产仔多、生长速度快等特点^[15]。目前，关于CXXC5基因的特征及其表达谱信息在猪中的研究报道较为有限，CXXC5在调节骨骼肌生长发育中可能起重要作用，但具体作用尚未得到充分阐明。因此，关于CXXC5基因对晋汾白猪骨骼肌生长发育影响的问题仍需要深入研究。

本研究通过生物信息学工具分析晋汾白猪CXXC5蛋白的基本理化性质和结构，利用qRT-PCR技术检测CXXC5基因在晋汾白猪不同发育阶段的骨骼肌组织中表达的动态变化及在不同组织中的差异表达情况，旨在为深入理解CXXC5基因的功能提供重要数据，为揭示CXXC5基因在猪骨骼肌生长发育中的调控机制提供理论依据，为相关疾病的机制研究和治疗提供新思路。

1 材料和方法

1.1 试验动物与样品收集

选用由山西大同种猪场提供的晋汾白猪9头，屠宰后采集其1、90、180 d的心、肝、脾、肺、肾、背肌、腹脂共7种组织器官，放入离心管中，液氮速冻，于-80 ℃保存备用。

1.2 总RNA提取及cDNA合成

采用Trizol法从晋汾白猪不同组织中提取总RNA，利用ND-1000核酸蛋白测定仪测定总RNA的OD_260/280值，确定RNA的纯度，按照反转录试剂盒的操作说明进行反转录合成cDNA。第1步反应体系10 µL：RNA 500 ng，5×gDNA Eraser buffer 2 µL，gDNA Eraser 1 µL，加RNase Free ddH₂O至10 µL。反应程序：振荡混匀并离心，42 ℃ 2 min，4 ℃ 5 min。第2步反应体系20 µL：第1步产物10 µL，RNase Free H₂O 4 µL，5×PrimeScript Buffer 2 4 µL，Prime Script RT Enzyme Mix 1 µL，RT Primer Mix 1 µL。反应程序：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。cDNA保存于-20 ℃。

1.3 CXXC5引物设计与合成

根据美国国家生物技术信息中心数据库中猪CXXC5基因序列进行预测，并且使用Primer Premier（v6.0）进行引物设计，引物序列见表1，引物均由上海生工生物公司合成。

1.4 qRT-PCR

qRT-PCR反应体系20 µL：cDNA 3 µL，2×SYBR qPCR Master Mix 10 µL，上下游引物各0.5 µL，RNase Free ddH₂O 6 µL。反应程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火31 s，72℃延伸25 s，共40个循环。

1.5 生物信息学分析

使用ClustalW软件构建不同物种中CXXC5同源基因的生物进化树，以评估这些基因之间的进化关系及同源程度。利用ExPASy服务器上的ProtParam工具分析CXXC5蛋白的基本物理化学性质，如分子质量、等电点（pI）、氨基酸组成等。通过SignalP 4.1服务器预测CXXC5蛋白是否含有信号肽及其可能的位置，理解蛋白质的分泌机制。使用ProtScale工具对CXXC5蛋白进行疏水性分析，用PSORT Ⅱ prediction 预测CXXC5蛋白亚细胞定位，即确定该蛋白最有可能存在于细胞内的哪个部分。分别用SOPMA和Swiss-model预测CXXC5蛋白的二级结构特征和三级结构模型。

1.6 数据处理与分析

试验中PCR结果数据采用SPSS 22.0软件进行处理，单因素方差分析各组数据间的差异。

2 结果与分析

2.1 猪CXXC5基因生物信息学分析

2.1.1 CXXC5基因系统进化树的构建

在本研究中，首先通过访问美国国家生物技术信息中心（NCBI）的GenBank数据库，获取了猪、牛、羊、鸡、人、小鼠、猫和犬这8个物种的CXXC5同源基因所编码的蛋白质序列，整理成表2，作为后续分析的基础数据。利用多序列比对工具ClustalW对上述蛋白质序列进行比对分析。基于比对结果，使用最大似然法构建了系统进化树（图1），直观地展示了不同物种间基于CXXC5蛋白序列的亲缘关系。结果显示，猪的CXXC5与牛、羊之间的亲缘关系最为接近，表明这3个哺乳动物的CXXC5在进化历史上拥有一个较近的共同祖先，并且它们的CXXC5蛋白序列表现出高度的保守性和相似性；其次依次是猫和犬，相比之下，猪的CXXC5与鸡之间的亲缘关系明显更加疏远。

2.1.2 CXXC5蛋白基本理化性质分析

通过ExPASy服务器中的ProtParam工具对CXXC5蛋白质进行理化性质分析，结果表明（表3），CXXC5蛋白质由322个氨基酸残基组成，其中，丙氨酸（Ala）的比例最高，为16.1%；色氨酸（Trp）的比例最低，为0.3%。CXXC5蛋白分子式为C₁₄₀₁H₂₂₇₉N₄₂₃O₄₄₅S₁₈，分子质量为32 968.81 u，理论等电点（pI）为9.35，正、负电残基总数分别为37、26个，亲水性总平均系数为-0.268，不稳定指数为50.68，超过了40的标准阈值，则该蛋白为不稳定蛋白。

2.1.3 CXXC5蛋白信号肽分析

利用SignalP 4.1服务器程序对猪CXXC5蛋白进行信号肽预测分析，以评估该蛋白是否具有分泌能力，结果显示（图2），CXXC5蛋白N端不存在明显的信号肽切割位点，即不包含信号肽序列，因此，该蛋白属于非分泌蛋白。

2.1.4 CXXC5蛋白亲、疏水性分析

利用ProtScale工具对CXXC5蛋白进行亲/疏水性分析，结果如图3所示，CXXC5蛋白由322个氨基酸残基组成，每个氨基酸都分配了1个亲水性得分，得分最低的是第258位氨基酸，为-2.956，表明这是整个蛋白质中最亲水的位置，相反，第111位和第112位氨基酸的得分最高，均为1.956，显示出最强的疏水性。这种分布模式暗示了CXXC5蛋白内部可能存在功能域或结构特征，这些区域的不同亲/疏水性质可能会对其三维折叠、与其他分子的相互作用以及最终的功能实现产生重要影响。进一步观察发现，在全部322个氨基酸中，超过半数以上的氨基酸得分小于0，这表明CXXC5蛋白整体上倾向于亲水性。

2.1.5 CXXC5蛋白亚细胞定位预测

用PSORTⅡ prediction软件程序对CXXC5蛋白进行亚细胞定位预测，结果显示（图4），CXXC5蛋白可能主要存在于细胞核内，概率高达78.3%，表明CXXC5蛋白很可能在细胞核中发挥其生物学功能。

2.1.6 CXXC5蛋白的高级结构预测

利用SOPMA软件对猪CXXC5蛋白的二级结构进行了预测分析，结果显示（图5），无规则卷曲占比最高，为43.8%，其次是α-螺旋，占总结构的42.6%，延伸链占比相对较低，为8.1%。对CXXC5蛋白进行三级结构预测，结果获得了CXXC5蛋白可能的三维模型，CXXC5蛋白呈现出一个复杂而有序的空间构象，其中，α-螺旋和无规则卷曲占据了主导地位（图6）。

2.2 猪CXXC5基因的表达特性分析

2.2.1 晋汾白猪CXXC5基因的时序表达特性分析

背最长肌组织中CXXC5基因在1、90、180 d的表达量如图7所示，背最长肌组织中CXXC5基因在90 d的表达量极显著高于180 d（P<0.01），在90 d表达量最高，在180 d表达量最低。

2.2.2 晋汾白猪CXXC5基因的组织表达特性分析

CXXC5基因在90 d晋汾白猪各组织中的表达情况如图8所示，CXXC5基因在晋汾白猪肝脏、背肌中表达量极显著高于心、肾脏和背脂（P<0.01），在脾脏和肺脏中表达量最低。

3 结论与讨论

CXXC5拥有广泛的生物学功能，包括信号转导、细胞凋亡、细胞能量代谢和血管生成^[16]，对于成纤维细胞、神经干细胞、心肌细胞等细胞的迁移和分化都具有重要作用^[17-18]。本研究分析了CXXC5基因在物种间的序列保守性，发现哺乳类样本在进化树中显示出了更近的亲缘关系，与非哺乳类样本如鸡，则有较大的分支分离。CXXC5蛋白为不稳定蛋白，不含信号肽，属于非分泌蛋白。信号肽为蛋白N端的一段疏水性氨基酸序列，该区域负责指引蛋白质在细胞内的运输^[19]，非分泌蛋白表示CXXC5可能参与细胞内的生物过程，如基因表达调控、细胞骨架组织等。此外，CXXC5蛋白为亲水性蛋白，意味着该蛋白更可能与水相溶，并且更容易分布在细胞质或其他水相环境中。PSORT Ⅱ的预测结果显示，猪CXXC5蛋白具有显著的细胞核定位倾向，表明它很可能参与细胞核内的生物过程，如DNA复制、转录调控、RNA加工以及其他染色质相关活动。已有研究发现，CXXC5蛋白定位于细胞核和细胞质中，且所有表达CXXC5的细胞核均出现了细胞核浓缩致密，表明CXXC5可能参与细胞凋亡^[20]。最后，预测CXXC5蛋白二级结构主要为无规则卷曲结构，其次依次为α-螺旋和延伸链结构，结构较为复杂，可能参与复杂的调控网络和多种生物学过程。

背肌是猪体内重要的骨骼肌之一，广泛应用于研究肌肉发育、生长和肉质特性。在本研究中，背最长肌作为骨骼肌的代表组织，被用于分析CXXC5基因在晋汾白猪骨骼肌生长发育中的表达变化。qRT-PCR检测CXXC5基因在1、90、180 d晋汾白猪背肌中的表达情况，发现在90 d时CXXC5基因的表达量最高，达到了3个时间点中的峰值，180 d时表达量最低。90 d时，晋汾白猪处于快速生长期，骨骼肌的肌纤维直径显著增大，肌肉质量快速积累，是骨骼肌发育的关键阶段。CXXC5基因表达量显著上升并达到峰值，表明其可能在骨骼肌快速生长和肌纤维增大过程中发挥重要调控作用，也可能通过调控细胞增殖、分化或信号通路（如Wnt/β-catenin通路）来促进骨骼肌的发育。180 d时，晋汾白猪的骨骼肌发育逐渐趋于成熟，CXXC5基因表达量下降至低水平，可能与其在骨骼肌发育中的调控作用减弱有关。

已有研究表明，CXXC5在成人组织中均有表达，且在肌肉、肾、食管中高表达，这表明其在不同组织中均有功能^[21]。通过分析CXXC5基因在晋汾白猪90 d时不同组织中的表达变化，发现其在7种组织中均有表达且具有显著差异，在肝脏和背肌中表达量相对较高，在脾脏和肺脏中表达量较低。肝脏是体内代谢的核心器官，在肝脏和背肌中的高表达可能与其在代谢调控和骨骼肌发育中的重要作用相关。相反，脾脏和肺脏的主要功能与免疫和呼吸相关，而非细胞增殖和代谢的核心器官，CXXC5基因在这2种组织中的低表达可能与其功能在这些组织中的调控作用较弱有关。总之，CXXC5基因在晋汾白猪不同组织中的表达差异反映了其功能的组织特异性，下一步还需深入探究CXXC5基因在骨骼肌生长发育中的潜在调控机制和分子调控网络。

本研究揭示了CXXC5基因的多种关键特性，并对其在晋汾白猪不同组织中的表达进行了深入分析，研究表明，CXXC5可能通过影响细胞增殖和参与多种信号通路等，对猪骨骼肌的生长发育起到调控作用。但其在猪骨骼肌生长发育中的研究还比较少。目前，关于猪骨骼肌生长发育的研究重点更多地集中在探究骨骼肌细胞分化过程中标志性的成肌因子^[22]，以及猪骨骼肌纤维类型和能量代谢相关基因的表达特性等方面^[23]。本研究结果不仅为理解CXXC5基因在猪骨骼肌发育中的分子机制提供了依据，还为其他物种中CXXC5同源基因功能的研究提供了参考，具有广泛的应用前景和科学价值。

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基金资助

山西省高等学校科技创新项目(2021L158)

山西省基础研究计划(20210302124639)