猪传染性胃肠炎病毒间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

Development and Application of an Indirect ELISA Antibody Detection Method for Porcine Transmissible Gastroenteritis Virus

摘要

猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）是一种高度传染性的病原体，会导致猪（尤其是仔猪）严重腹泻，造成重大经济损失。为建立一种用于TGEV血清抗体的高特异性、高灵敏度的间接ELISA检测方法，为监测猪传染性胃肠炎病毒在猪场的流行情况以及免疫后抗体水平评价提供技术支撑，以灭活的TGEV HN—2012株全病毒作为固相包被抗原，系统性优化反应参数，确定最佳反应条件。结果表明，建立的间接ELISA检测方法阴阳性临界值为0.439 2，最佳反应条件为：用碳酸盐缓冲液将灭活后的抗原（灭活前病毒滴度1.0×10⁷ TCID₅₀/mL）1∶8稀释，50 μL/孔，37 ℃孵育3 h；2.5% BSA 37 ℃封闭2 h；血清样本稀释比例为1∶64，37 ℃孵育45 min；酶标抗体1∶6 000稀释，37 ℃孵育60 min；TMB显色10 min。该检测方法特异性好，与其他常见猪病毒阳性血清均无交叉反应；敏感性高，高免阳性血清1∶1 024倍稀释时检测结果仍为阳性；批内、批间重复性好，变异系数均小于10%；利用所建立的ELISA方法对100份疑似感染TGEV的猪血清样品进行检测，结果与血清中和试验符合率为98%。对河南省588份临床疑似感染猪传染性胃肠炎病毒的血清样品进行检测，抗体阳性率为64.97%。

Abstract

Porcine transmissible gastroenteritis virus(TGEV) is a highly contagious pathogen that can cause severe diarrhea in pigs, especially piglets, leading to significant economic losses. Aiming to establish a highly specific and sensitive indirect ELISA detection method for TGEV serum antibody to provide technical support for monitoring the prevalence of porcine transmissible gastroenteritis virus in pig farms and evaluating antibody levels after immunization, in this study, using inactivated whole virus of the TGEV HN-2012 strain as the solid-phase coating antigen, a highly specific indirect ELISA detection method was constructed by systematically optimizing the reaction parameters, and the optimal reaction conditions were determined. The results showed that the cut-off value for positive/negative of the established indirect ELISA detection method was 0.4 392, the optimal reaction conditions were as follows: the inactivated antigen (virus titer before inactivation: 10-7.0 TCID50/ml) diluted 1∶8 with carbonate buffer, 50 μL/well, incubated at 37 ℃ for 3 h, and blocked with 2.5% of BSA at 37 ℃ for 2 h; serum samples diluted 1∶64, incubated at 37 ℃ for 45 min; enzyme-labeled antibody diluted 1∶6,000, incubated at 37°C for 60 min; TMB color development for 10 min. This detection method exhibited good specificity, with no cross-reactivity with positive sera from other common porcine viruses; high sensitivity, as hyperimmune positive serum diluted 1∶102 4 still yielded positive results; and good intra- and inter-batch reproducibility, with coefficients of variation less than 10%. Using the established ELISA method, 100 pig serum samples suspected of TGEV infection were tested, and the concordance rate between the detection results and the serum neutralization test was 98%. Detection of 588 clinical serum samples from Henan province suspected of porcine transmissible gastroenteritis virus infection showed an antibody positive rate of 64.97%.

Graphical abstract

关键词

猪传染性胃肠炎病毒 / ELISA / 血清学 / 流行病学

Key words

Transmissible gastroenteritis virus(TGEV) / ELISA / serology / epidemiology

猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）是引发猪急性、高度传染性腹泻的主要病原体，可造成养殖业重大经济损失^[1-2]。TGEV主要定植于猪小肠组织，通过破坏肠绒毛结构引发肠道稳态失衡，造成仔猪严重腹泻及营养代谢障碍^[3-6]。值得注意的是，TGEV具有跨物种传播能力，可感染猫、犬等哺乳动物^[7-9]。TGEV主要依赖疫苗免疫进行防控，及时、准确地监测TGEV抗体水平，是科学防控TGEV的基础。TGEV血清学方法包括中和试验（Neutralization test，NT）、间接免疫荧光法（Indirect fluorescent Assay，IFA）、胶体金免疫层析（Gold immunochromatographic assay，GICA）、免疫过氧化物酶单层试验（Immunoperoxidase monolayer assay，IPMA）等^[10-13]。ELISA方法与其他方法相比，在灵敏度、通量、标准化、安全性等方面有明显优势，尤其适合猪群大规模监测和临床诊断。

TGEV基因组为单股正链不分节段的RNA，全长28~30 kb，其中，4种主要结构蛋白在病毒生命周期及免疫识别中发挥关键作用，核衣壳蛋白（N）是病毒核衣壳的核心组成成分，主要包裹病毒RNA基因组以维持其稳定性，同时也是机体免疫应答早期识别的重要靶标；纤突糖蛋白（S）位于病毒颗粒表面，通过介导病毒与宿主细胞表面受体的结合及膜融合参与感染起始过程，是诱导中和抗体产生的主要抗原；膜糖蛋白（M）是病毒包膜的核心结构蛋白，在病毒装配与出芽过程中起关键调控作用；小膜蛋白（sM）则作为辅助结构蛋白，与M蛋白协同参与病毒包膜的形成与成熟。已有基于TGEV N蛋白或S蛋白的间接ELISA研究^[14-16]，由于N蛋白抗体通常在感染早期出现，而S蛋白抗体在中后期逐渐上升，因此，仅使用单一重组蛋白的ELISA抗体无法捕捉到不同感染阶段的动态抗体谱，导致诊断窗口受限。

本研究在动物病原与生物安全教育部重点实验室的TGEV分离纯化灭活研究的基础上^[17]，系统评估以灭活全病毒抗原作为包被抗原构建ELISA抗体检测方法的特异性、敏感性、重复性及临床适用性，旨在为TGEV的快速诊断和疫病防控提供技术支撑。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 毒株、血清与细胞

TGEV HN-2012毒株、猪睾丸细胞（Swine testis cell，ST细胞）、TGEV、伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）、猪圆环病毒2（Porcine circovirus，PCV2）、猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）、猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndromevirus，PRRSV）、猪丁型冠状病毒（Porcine deltacoronavirus，PDCoV）、猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）阳性血清和猪阴性血清样本均由动物病原与生物安全教育部重点实验室制备、鉴定和提供。

1.1.2 临床样品来源

采集河南7个地市的25个猪场血清样品共588份，每份2~3 mL，样品低温加冰包装后24 h内送回实验室待处理。离心后，取上层血清保存备检。

1.2 主要试剂

HRP-标记的羊抗猪IgG（武汉三鹰生物技术有限公司）、牛血清白蛋白（BSA）（西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司）、ProClin-300（北京索莱宝科技有限公司）、3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）（上海麦克林生化科技股份有限公司）、Difco^TM Skim Milk（美国BD公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 抗原包被液的选择

采用磷酸盐缓冲液PBS（10 mmol/L，pH＝7.4）、CB（50 mmol/L，pH＝9.6）、TB（0.1 mol/L，pH＝7.5）、硼酸缓冲液（50 mmol/L，pH＝8.0）等不同包被液对TGEV病毒原液（1×10⁷ TCID₅₀/mL）进行稀释，将稀释的病毒溶液包被酶标板，将TGEV阴阳性血清用抗体稀释液进行稀释，后将稀释液100 µL/孔加入酶标板中，37 ℃孵育1 h。洗板5次并拍干，用酶标抗体稀释液将HRP-羊抗猪IgG抗体进行稀释，加入酶标板中37 ℃反应1 h。洗板5次后，加入TMB显色液100 µL/孔，37 ℃反应5~10 min，每孔加入50 µL终止液。反应结束后30 min内测定OD₄₅₀。以阴性血清的OD₄₅₀为噪声背景值，阳性血清的OD₄₅₀为信号值，计算出信噪比（Signal to Noise，S/N值），以确定最佳抗原包被液。

1.3.2 抗原包被条件的选择

在以上优化条件的基础上分别设置冷包和热包2种模式，其中，冷包为抗原4 ℃包被16 h，热包为抗原37 ℃包被3 h。按照1.3.1的方法进行后续试验，通过测定OD₄₅₀计算S/N值，以确定最佳抗原包被条件。

1.3.3 包被抗原浓度的选择

以优化的血清稀释度为基础进行抗原包被条件的优化。将已灭活的TGEV病毒液进行1/2、1/4、1/8、1/16、1/32~1/256倍比稀释，将稀释液每孔100 µL加入酶标板中，37 ℃包被3 h。按照1.3.1的方法进行后续试验，通过测定OD₄₅₀计算S/N值，从而确定最佳包被抗原浓度。

1.3.4 封闭液的选择

在确定抗原包被浓度以及血清稀释度的基础上对封闭条件进行优化。选取2.5% BSA、1% BSA、2.5% S.M.、1% S.M.、2.5%（BSA+S.M.）、1%（BSA+S.M.）、2.5% S.M.+1% BSA、1% S.M.+2.5% BSA为封闭液，加入酶标板中37 ℃恒温孵育2 h，待封闭结束，按照1.3.1的方法进行后续试验，通过测定OD₄₅₀计算S/N值，以确定最佳封闭液。

1.3.5 待检抗体孵育时间的选择

在确定封闭条件的基础上对待检抗体孵育时间进行优化。设定15、30、45、60 min等4个时间对PDCoV-N-ELISA、TGEV-V-ELISA等2种方法进行优化，按照1.3.1的方法进行后续试验，通过测定OD₄₅₀计算S/N值，以确定最佳待检抗体孵育时间。

1.3.6 酶标抗体稀释度的选择

在确定以上条件的基础之上对酶标抗体稀释度进行条件优化。将带有HRP羊抗猪多克隆抗体进行1/2 000、1/4 000、1/8 000、1/16 000、1/32 000梯度稀释，加入已封闭完成的酶标板中，37 ℃孵育60 min。按照1.3.1的方法进行后续试验，通过测定OD₄₅₀计算S/N值，以确定最佳酶标抗体稀释度。

1.3.7 酶标抗体孵育时间的选择

在以上基础上对酶标抗体孵育时间进行条件优化。设定15、30、45、60 min等4个时间段，按照1.3.1的方法进行后续试验，通过测定OD₄₅₀计算S/N值，最高者即为最佳酶标抗体孵育时间。

1.3.8 显色时间的选择

在确定以上条件的基础之上对显色时间进行条件优化。将显色时间设定为5、10、15、20、30 min，待显色完成后加入50 µL的终止液，测定OD₄₅₀，计算S/N值，以确定最佳显色反应时间。

1.3.9 临界值判定

按照最佳反应条件建立的间接ELISA方法，检测100份TGEV临床血清（60份阳性血清，40份阴性血清），通过GraphPad Prism 8.0进行数据统计分析并绘制ROC曲线，从ROC曲线中得出各切点的灵敏度和特异性，并计算Youden指数，从而判定TGEV-V-ELISA方法的临界值。

1.3.10 特异性评估

利用所建立的间接ELISA方法检测PRRSV、PEDV、CSFV、ASFV、PRV、PCV、PDCoV阳性血清和猪阴性血清，设立标准阳性对照组，以此确定该方法的特异性。

1.3.11 灵敏度评估

将TGEV病毒阳性血清按照1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128~1/8 192倍比稀释，利用所建立的间接ELISA方法进行检测，通过判定标准确定该方法的灵敏度。

1.3.12 重复性评估

批内重复性：使用同一批次酶标板，利用所建立的间接ELISA方法对10份血清样品（含5份阳性血清和5份阴性血清）进行检测，每个样品检测3次，计算批内变异系数（Coefficient of variation，CV）。批间重复性：使用不同批次酶标板，于3个不同时间段利用所建立的间接ELISA方法对上述10份血清样本进行3次检测，计算批间变异系数（CV）。

CV=标准差/平均数×100%（1）

1.4 临床样品检测

用已优化的TGEV间接ELISA抗体检测方法，对分别收集于河南省郑州市、焦作市、许昌市、安阳市、驻马店市、新乡市、济源市共7个市级地区的多家不同规模生猪养殖基地的588份待检血清进行检测，统计其阳性率。

1.5 血清中和比对试验

为了进一步验证TGEV间接ELISA抗体方法的检测结果，选取100份临床血清进行血清中和试验，其中，阳性血清60份，阴性血清40份，并计算符合率。血清中和试验的具体步骤如下：在96孔细胞培养板上从1∶4开始倍比稀释血清，稀释至1∶512，每个稀释度重复3孔，保留50 μL/孔，然后加200个TCID₅₀的TGEV HN—2012株病毒液50 μL/孔；振荡1~2 min，置37 ℃孵育1 h；再加ST细胞悬液（10⁵ 个/mL）50 μL/孔，同时设TGEV阴/阳性血清、病毒、正常细胞对照孔，培养板置于37 ℃、5% CO₂培养箱，72 h后判定结果。以病毒孔和阴性血清对照孔均出现细胞致病变效应（CPE）、阳性血清及正常细胞对照组均无CPE为试验成立，将能抑制50%以上细胞出现CPE的血清最高稀释度判定为待检血清样本的TGEV抗体效价，中和抗体效价>1∶4为TGEV阳性血清，中和抗体效价<1∶2为TGEV阴性血清。

2 结果与分析

2.1 间接ELISA方法的条件优化

选定S/N值较大且阴/阳性值在合理范围内的反应条件为该ELISA方法的最优反应条件，结果如图1所示，TGEV最佳的包被液为CB，最佳包被条件为37 ℃包被3 h，TGEV病毒的最佳包被浓度为1∶8稀释（病毒效价为10⁷TCID₅₀/mL），最佳封闭液为2.5% BSA。待检血清最佳孵育时间为45 min，酶标抗体最佳稀释度为1∶6 000；酶标抗体最佳孵育时间为60 min，TMB最佳显色时间为10 min。

2.2 临界值确定

以所优化的条件为基础检测100份TGEV临床血清，ROC曲线如图2所示。以最大的Youden指数为确定灵敏度和特异度的依据，可知灵敏度和特异度分别为95.00%和97.50%；相对应的吸光度值为0.439 2，此时曲线下面积为0.992 1，95%可信区间为0.871 2~0.998 7。因此，当OD₄₅₀>0.439 2时判定为阳性，反之则为阴性。

2.3 特异性和灵敏度检测

选取PRV、PCV2、CSFV、PRRSV、PDCoV、PEDV阳性血清用于判定TEGV间接ELISA的特异性，结果如图3所示，在阴性血清检测为阴性值的基础上，确定TGEV阳性血清为阳性，其余血清检测均为阴性，表明建立的TGEV间接ELISA抗体检测方法与其他血清无交叉反应，具有较好的特异性。TGEV阳性血清稀释到1∶1 024时，结果仍为阳性，表明建立的TGEV间接ELISA抗体检测方法具有较高的灵敏度。

2.4 重复性试验结果

所建立的间接ELISA抗体检测方法批内变异系数为0.94%~4.95%，批间变异系数为1.64%~7.63%，二者均小于8%，表明该检测方法具有良好的重复性（表1）。

2.5 临床检测情况

由表2可知，TGEV总体阳性率为64.97%，其中，新乡市地区的阳性率最高，为92.86%；郑州市地区的阳性率最低，为30.08%；焦作市的阳性率为60.83%；许昌市的阳性率为79.41%；安阳市的阳性率为76.32%；驻马店市的阳性率为62.32%；济源市的阳性率为63.89%，表明河南省不同地区的阳性率的差别较大。

从不同季节临床血清TGEV IgG抗体检测情况可以看出，河南省内地区春季、冬季血清阳性率分别为84.91%和75.96%，夏季、秋季血清阳性率分别为69.52%和67.53%，表明TGEV在寒冷季节的流行情况比较严重（表3）。

2.6 符合率分析

将TGEV间接ELISA与血清中和试验结果进行比较，2种检测方法的阳性血清符合率为96.67%、阴性血清符合率为100%，总符合率为98%（表4）。

3 结论与讨论

近年来，非洲猪瘟疫情过后，养猪行业重新蓬勃发展，生物安全防控设备、疫苗及防控措施均有所提升，猪群急性传染病感染情况得以改善，但猪群传染性胃肠炎仍是需重点关注的防控对象之一^[18]，预防和治疗猪传染性胃肠炎是养殖业的关键任务。现有研究均成功构建了用于检测猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）血清抗体的间接ELISA方法，证实了ELISA技术在TGEV血清学诊断中的可行性与可靠性^[14-15，19]。抗原的不同明显影响ELISA方法的检测水平，以N蛋白为抗原的ELISA检测方法批内、批间CV均小于5%，特异性为100%^[14]；而以S基因B、C位点片段为抗原的ELISA检测方法特异性和符合率分别为96.4%、84.0%^[15]。本研究采用灭活TGEV HN—2012株全病毒为抗原，通过优化反应参数，高免血清1∶1 024稀释仍可检出，与常见猪病毒无交叉反应，与中和试验98%一致，变异系数小于10%。实现了高敏感度、良好的特异性及较高临床符合率，同时批内、批间重复性好，优于单一的N蛋白或S蛋白的方法。

本研究构建的全病毒间接ELISA方法与中和试验相比，虽有较高的符合率，但是依然有2份阳性样品漏检，可能来源于临床TGEV变异株，其表面抗原（如S蛋白）的关键表位发生氨基酸突变，导致HN—2012株全病毒抗原无法与变异株诱导产生的抗体有效结合；或是血清样本中存在的干扰物质（如类风湿因子、猪血清中的补体成分、非特异性免疫球蛋白）进一步抑制了抗原-抗体结合反应，导致OD值低于临界值而被判为阴性。后续研究将优化全病毒抗原制备工艺，提高抗原稳定性，降低批间CV至5%以内；进一步构建“全病毒+重组N蛋白”双抗原ELISA体系，利用全病毒的高敏感度与N蛋白的高特异性互补，提升检测性能；同时扩大临床样本范围，纳入不同日龄、不同地区及免疫抑制状态的猪血清，验证其临床普适性。

本研究对河南省7个地市共588份临床血清检测出TGEV抗体阳性率64.97%，因采样均来自腹泻或PCR阳性场，可能会导致阳性率偏高。地区差异显著，许昌最高，为79.41%，郑州最低，为30.08%，提示不同地域的养殖场管理水平、生物安全措施（如消毒、隔离）等存在差异，加强生物安全防控措施和猪群卫生管理对于TGEV等腹泻相关病毒的防控也具有重要意义^[20]。冬季阳性率高于暖季，表明低温利于病毒存活^[21-22]。

综上，本研究建立的间接ELISA方法可用于监测猪群中TGEV的抗体水平，为TGEV的防控提供可靠的检测手段。

参考文献

[1] PU J N， CHEN D W， TIAN G，et al. All-trans retinoic acid attenuates transmissible gastroenteritis virus-induced inflammation in IPEC-J2 cells via suppressing the RLRs/NF-κB signaling pathway[J]. Frontiers in Immunology，2022，13：734171.

[2] YANG Y， YU Q H， SONG H，et al. Decreased NHE3 activity and trafficking in TGEV-infected IPEC-J2 cells via the SGLT1-mediated P38 MAPK/AKt2 pathway[J]. Virus Research，2020，280：197901.

[3] 张祎，汤宇心，史晨曦，等. 基于网络药理学和分子对接技术研究芹黄素抗猪传染性胃肠炎病毒的作用[J]. 中国兽医学报，2025，45（2）：312-321.

[4] ZHANG Y， TANG Y X， SHI C X，et al. Research on mechanism of apigenin against transmissible gastroenteritis virus infection based on network pharmacology and molecular docking[J]. Chinese Journal of Veterinary Science，2025，45（2）：312-321.

[5] 陈建飞，石达，时洪艳，等. 猪主要病毒性腹泻防控技术与应用[J]. 中国科学：生命科学，2023，53（12）：1754-1766.

[6] CHEN J F， SHI D， SHI H Y，et al. The technologies and their applications in the prevention and control of main porcine viral diarrhea[J]. Scientia Sinica（Vitae），2023，53（12）：1754-1766.

[7] CHENG S P， WU H G， CHEN Z H. Evolution of transmissible gastroenteritis virus（TGEV）：a Codon usage perspective[J]. International Journal of Molecular Sciences，2020，21（21）：7898.

[8] ZHANG Y F， XIA L， YUAN Y X，et al. Rhodanine derivative LJ001 inhibits TGEV and PDCoV replication in vitro [J]. Virus Research，2020，289：198167.

[9] CHEN Y W， ZHANG Y Z， WANG X，et al. Transmissible gastroenteritis virus：an update review and perspective[J]. Viruses，2023，15（2）：359.

[10] CANTERO M， CARLERO D， CHICHÓN F J，et al. Monitoring SARS-CoV-2 surrogate TGEV individual virions structure survival under harsh physicochemical environments[J]. Cells，2022，11（11）：1759.

[11] TIAN Y Y， SUN J Q， HOU X H，et al. Cross-species recognition of two porcine coronaviruses to their cellular receptor aminopeptidase N of dogs and seven other species[J]. PLoS Pathogens，2025，21（1）：e1012836.

[12] 路浩，丁雪燕，袁晋，等. 猪肠道冠状病毒检测方法的研究进展[J]. 中国兽医科学，2024，54（10）：1391-1398.

[13] LU H， DING X Y， YUAN J，et al. Research progress on detection methods of swine enteric coronavirus[J]. Chinese Veterinary Science，2024，54（10）：1391-1398.

[14] 吴芳. 胶体金免疫层析技术在兽医领域的应用[J]. 现代畜牧科技，2024（8）：163-166.

[15] WU F. Application of colloidal gold immunochromatography technology in the field of veterinary medicine[J]. Modern Animal Husbandry Science & Technology，2024（8）：163-166.

[16] 王一鹏. TGEV单克隆抗体及抗原检测胶体金试纸条的制备[D]. 保定：河北农业大学，2019.

[17] WANG Y P. Preparation of tgev monoclonal antibody and antigendetection colloidal gold test strip[D]. Baoding：Hebei Agricultural University，2019.

[18] PENSAERT M B， HALTERMAN E O， BURNSTEIN T. Diagnosis of transmissible gastroenteritis in pigs by means of immunofluorescence[J]. Canadian journal of comparative medicine. Revue canadienne de medecine comparee，1968，32（4）：555-561.

[19] 郭宏伟，郑鸣，乔宏兴，等. 猪传染性胃肠炎病毒N蛋白原核表达和间接ELISA检测方法的建立[J]. 中国畜牧兽医，2016，43（9）：2296-2301.

[20] GUO H W， ZHENG M， QIAO H X，et al. Prokaryotic expression and development of an indirect ELISA detection method of porcine transmissible gastroenteritis virus N protein[J]. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine，2016，43（9）：2296-2301.

[21] 尹杰，杨恒，曹三杰，等. 猪传染性胃肠炎病毒S基因B、C位点的克隆与表达及间接ELISA方法的建立[J]. 中国兽医杂志，2015，51（1）：7-10.

[22] YIN J， YANG H， CAO S J，et al. Cloning and expression of the SBC gene of transmissible gastroenteritis virus and development of an indirect TGEV SBC-ELISA[J]. Chinese Journal of Veterinary Medicine，2015，51（1）：7-10.

[23] WANG G， LIANG R， LIU Z W，et al. The N-terminal domain of spike protein is not the enteric tropism determinant for transmissible gastroenteritis virus in piglets[J]. Viruses，2019，11（4）：313.

[24] ZHAO F J， LIU L T， XU M L，et al. Assessments of different inactivating reagents in formulating transmissible gastroenteritis virus vaccine[J]. Virology Journal，2020，17（1）：163.

[25] 吕林丹，牟豪，胡霞，等. 猪传染性胃肠炎病毒S基因RAA检测方法的建立与初步应用[J]. 畜牧兽医学报，2024，55（8）：3590-3599.

[26] LÜ L D， MOU H， HU X，et al. Establishment and preliminary application of RAA assay for the detection of porcine transmissible gastroenteritis virus based on S gene[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，2024，55（8）：3590-3599.

[27] 牟春晓，朱立麒，邢宪平，等. 猪传染性胃肠炎病毒S基因主要抗原位点A和D的原核表达及间接ELISA检测方法的建立[J]. 中国兽医科学，2015，45（4）：356-360.

[28] MOU C X， ZHU L Q， XING X P，et al. Expression of major antigenic sites A and D in S gene of transmissible gastroenteritis virus of swine（TGEV） in Escherichia coli and development of indirect ELISA for detection of the antibody against TGEV[J]. Chinese Veterinary Science，2015，45（4）：356-360.

[29] 李英. 猪传染性胃肠炎综合防控措施[J]. 畜牧兽医科学（电子版），2021（9）：88-89.

[30] LI Y. Comprehensive prevention and control measures for swine infectious gastroenteritis[J]. Graziery Veterinary Sciences（Electronic Version），2021（9）：88-89.

[31] CHEN X L， ZHANG X X， LI C X，et al. Epidemiology of porcine epidemic diarrhea virus among Chinese pig populations：a meta-analysis[J]. Microbial Pathogenesis，2019，129：43-49.

[32] PIÑEYRO P E， LOZADA M I， ALARCÓN L V，et al. First retrospective studies with etiological confirmation of porcine transmissible gastroenteritis virus infection in Argentina [J]. BMC Veterinary Research，2018，14（1）：292.

基金资助

河南省重点研发专项(231111113100)

河南省自然科学基金(232300421001)